腸道菌群與肝臟切除術后肝臟再生代謝通路的相關性研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 肝臟部分切除術后肝臟損傷修復不同病理階段的界定
　　目的：肝臟具備強大的再生能力，能在遭受炎癥或外科手段打擊下，通過肝細胞的代償性肥大或增殖來修復正常的體積和功能。大部分肝臟切除術所構建的肝臟再生往往伴隨著不同程度的炎癥損傷，使我們在機制研究中難以判別所研究參數(shù)是起有害或有利于再生的作用，因此明確區(qū)分界定肝臟再生過程的不同生理階段，將為后續(xù)的研究奠定扎實的基礎。
　　方法：

2、本研究采用70％大部分肝臟切除手術(partial hepatectomy, PH)構建肝臟再生模型。126只雄性SD大鼠隨機分為三個大組:正常對照組(n=6)，假手術組(n=60)和肝臟切除組(n=60)。其中假手術組和肝臟切除組分別根據(jù)大鼠處死時間分成十個亞組:12、18、24、30、36、48、72小時、7天、10天和14天。采集下腔靜脈血用于生化指標檢測，肝組織用作病理學、免疫組化和細胞因子mRNA(腫瘤壞死因子-α(TNF-α

3、)、白介素6(IL-6)、肝細胞生長因子(HGF)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β))檢測。
　　結果：血液中肝臟生化功能指標（ALT、AST和膽紅素）在術后24小時內(nèi)達到高峰，術后72小時恢復正常水平;同樣，肝臟病理學鏡檢結果和炎癥評分也顯示肝臟炎癥損傷在術后24小時最嚴重。5-BrdU和Ki-67陽性的肝細胞比例反映了進入細胞周期S期和活躍期的細胞比重，免疫組化染色結果顯示肝細胞再生活動在術后30小時明顯增加，至48小時進入S期

4、的肝細胞比例最高。肝內(nèi)各細胞因子mRNA表達在術后迅速上調(diào)，并分別于24小時（TNF-α和IL-6、），18小時(HGF)和72小時(TGF-β)達到最高水平。
　　結論：根據(jù)PH術后炎癥和再生指標的不同表現(xiàn)，本實驗中我們可以把肝臟再生分成以下三個階段:啟動期（12-24小時）、增殖期（30-48小時）和終止期(3-14天)。
　　第二部分 肝臟再生過程腸道菌群結構變遷
　　目的：腸道菌群及其代謝物質(zhì)通過肝-腸軸與肝臟

5、在解剖及功能上密切相關，已經(jīng)腸道細菌在肝臟再生過程中扮演重要角色，然而腸道微生物群落中影響肝臟再生的關鍵功能菌迄今為止沒有深入研究過。
　　方法：本研究采用MiSeq2000測序技術結合多變量統(tǒng)計學方法，對來自肝臟切除大鼠的糞便樣品腸道細菌多樣性及其組成進行了詳盡的分析，并且在PICRUSt工具（通過隱性狀態(tài)重建群落系統(tǒng)進化的研究）的幫助下，發(fā)掘腸道細菌功能基因的變化。
　　結果：研究發(fā)現(xiàn)PH大鼠腸道細菌多樣性與正常組無明顯

6、差異。對腸道細菌多樣性組成的整體結構特征進行主坐標分析和非線性多維度分析，顯示不僅是PH組與正常組存在明顯的腸道細菌結構差異，不同時間點的PHx組間也發(fā)生了菌群構成的變遷。在門的水平上，與正常對照組相比，PHx糞便內(nèi)容物中厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門豐度均發(fā)生了明顯改變。在再生早期（12-24小時），厚壁菌門相對含量明顯升高，隨著肝細胞再生的活躍，其豐度逐漸下降，48小時降至最低水平，令人意外的是，厚壁菌門在術后的3-14天并未恢復正常

7、水平，而是維持較高的相對含量。而擬桿菌門則呈現(xiàn)相反的變化趨勢。相對應的是，厚壁菌門/擬桿菌門比值也經(jīng)歷了降低-升高-降低的波動過程，提示腸道菌群在肝臟再生過程中不斷調(diào)整結構，改變能量攝取效率。厚壁菌門的改變歸因于Ruminococcaceae和Lachnospiraceae，而擬桿菌門的變化主要由Bacteroidaceae、Prevotellaceae、Rikenellaceae和Porphyromonadaceae引起。同時我們在細

8、菌相對豐度的基礎上，在綱、目、科的水平上對樣品進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)在科的水平上來自12-24小時、30-48小時和3-14天的糞便樣品可以被清楚地分為三個簇，與第一部分中肝臟再生三個生理階段的劃分相符。因此在下一步功能基因預測分析中，我們分別選用12小時、48小時和14天作為每一階段的標志時間點。在術后12小時，腸道菌群功能基因在與代謝相關的途徑相對含量較高，如“l(fā)ipis metabolism”、“carbohydratemetabol

9、ism”，而48小時細菌的編碼基因更多的與基因生物合成加工有關，如“replication and repair”，同時在與腸道細菌代謝物質(zhì)相關的功能類群的相對含量也較高。
　　結論：本研究描繪了肝臟再生過程中腸道微生物群落的整體結構的變化，鑒定出與肝再生相關的關鍵功能菌，并初步解讀這些細菌的潛在功能，為理解腸道細菌和肝臟再生的重要關系提供了基礎數(shù)據(jù)。
　　第三部分 肝臟再生過程中腸道菌群與代謝物質(zhì)共變化研究
　　目的

10、：肝臟部分切除所觸發(fā)的肝細胞增殖活動使機體對能量的需求增加，正如本研究第二部分中觀察到的，腸道菌群作為功能性“代謝器官”，其功能基因組調(diào)節(jié)的代謝途徑在PH術后發(fā)生了改變，這些變化是否參與了肝臟再生宿主代謝過程仍是個謎題，也正是本研究第三部分的探討重點。
　　方法：通過超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC/MS)技術鑒定肝臟再生宿主代謝譜特征，篩選肝再生相關的生物標志物，并結合代謝途徑分析法(MetPA)確定差異性代謝通路，最終建立肝臟再

11、生過程中腸道菌群與代謝途徑的關聯(lián)。
　　結果：應用主成分分析及正交偏最小二乘-判別分析法對UPLS/MS數(shù)據(jù)分析顯示，肝臟再生早期（12-24小時）、中期（30-36小時）及晚期（3-14天）血液樣品的代謝譜在空間上均能得到很好的區(qū)隔。根據(jù)VIP和非參數(shù)t-test結果，我們鑒定了在正常組與PH間有顯著差異的84個標志物，主要包括七大類物質(zhì):膽汁酸、膽素原、甘油磷脂、氨基酸、脂肪酸、?；舛緣A和維生素。在這84個代謝物中，我們發(fā)現(xiàn)

12、有15個物質(zhì)在肝臟再生的三個不同階段也存在表達差異，分別為腦磷脂(PE)(20∶4/14∶0)、卵磷脂(PC)(22∶5/15∶0)、PC(20∶3/15∶0)、溶血卵磷脂(Lysopc)(18∶4)、L-辛酰基肉堿、膽紅素、L-尿膽原、泛素、D-白氨酸、D-葡萄糖胺、2，3-二氨基丙酸、1-甲基組胺、核糖醇、庚二酸、3-硫代脫氧膽酸鵝和亞牛磺酸。經(jīng)MetPA軟件分析，上述16種差異物質(zhì)積聚的代謝通路有花生四烯酸代謝、亞麻酸代謝、甘油磷

13、脂代謝、GPI錨蛋白生物合成、組氨酸代謝、?；撬峒皝喤；撬岽x、泛酸及輔酶A代謝、卟啉及葉綠素代謝。其中甘油磷脂和?；撬峒皝喤；撬岽x被鑒定為對代謝差異貢獻最大的兩條通路。最后結合spearman，rank correlation分析，將腸道菌群相對豐度數(shù)據(jù)與血液生物標志物相對強度加以聯(lián)系，尋找腸道細菌結構與宿主整體代謝的共變化特征，并且鑒定出8種與肝再生代謝密切的重要腸道細菌成員，分別是毛螺菌科、普雷沃氏菌科、瘤胃菌科、擬桿菌科、理研

14、菌科、紫單胞菌科、梭菌科和柔膜菌科。其中一些細菌與多種血液代謝濃度變化相關，如Butyricimonas、Erysipelotrichaceae incertae sedis和Paraprevotella，提示了這些細菌可能影響著肝再生過程中多個代謝通路。
　　結論：本研究中在描繪肝臟再生相關宿主代謝特征的同時，建立了腸道菌群與特征代謝物間的聯(lián)系，提示腸道菌群參與調(diào)節(jié)肝臟再生過程中的代謝平衡，為維持正常肝臟再生功能提供了新的研究視