HIF-2α在冠心病患者單核細胞中的表達及其對泡沫細胞形成影響的研究.pdf

1、背景：
　　冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary atherosclerosis heart disease，CHD），簡稱冠心病，是嚴重威脅全世界人類健康最重要的心血管疾病之一。它主要的病例生理是冠狀動脈壁內(nèi)過多的脂質(zhì)沉積，促使粥樣硬化斑塊的形成，導致血管腔狹窄或阻塞，或因冠狀動脈痙攣導致心肌細胞缺血缺氧或壞死而引起的相關心臟病變，亦稱缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD）。
　　缺氧作

2、為一種常見的生理和病理現(xiàn)象，近年來，也被發(fā)現(xiàn)同樣存在動脈粥樣硬化中，其在動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。血管的狹窄或痙攣，導致供血供氧的減少，而斑塊中局部炎癥導致耗氧增加，這樣導致了氧的供需失衡，進一步加劇斑塊中缺氧的發(fā)生。缺氧可導致缺氧誘導因子（HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α）的高表達。缺氧可以促進斑塊中泡沫細胞的形成，促進炎癥進展，加快 ATP消耗，促進斑塊中微血管形成，進而促使斑塊進展。早期，我們課題組也對

3、HIF-1α和冠狀動脈粥樣硬化之間的聯(lián)系進行了相關研究，發(fā)現(xiàn)其在外周血炎癥細胞的表達水平與冠心病的嚴重程度相關。體外細胞、動物模型中也證實其對動脈粥樣硬化形成的促進作用。而對于與HIF-1α結(jié)構(gòu)類似的HIF-2α卻未被深入探討及研究。
　　過多的脂質(zhì)沉積于冠狀動脈壁，泡沫細胞聚集并形成斑塊是導致冠狀動脈粥樣硬化的主要環(huán)節(jié)之一,泡沫細胞主要來源于由內(nèi)皮細胞間的間隙移入內(nèi)膜下的單核細胞，其可分化成巨噬細胞并吞噬過剩的脂質(zhì)后變成泡沫細胞

4、。脂肪分化相關蛋白(adipose differentiation-related protein, ADRP)，亦稱plin2，是脂滴形成的相關蛋白，存在于脂滴表面，近來研究表明它可反映細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚、與脂肪積聚相關疾病的靈敏而特異的指標，并且顯示與脂質(zhì)代謝紊亂為特征的代謝綜合癥及動脈粥樣硬化有著密切聯(lián)系。
　　缺氧在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重大作用，其主要可以促使泡沫細胞的形成及進行一系列的炎癥反應。已有研究報道在體外細

5、胞及動物模型上，缺氧可促使 ADRP的高表達，從而促進脂質(zhì)堆積及泡沫細胞的形成，進而促進AS的進展。然而缺氧條件下，可同時誘導缺氧誘導因子1α、2α、3α的高表達，且有部分文獻證實在腫瘤細胞中HIF-2α對ADRP具有調(diào)控作用，HIF-2α通過誘導plin2高表達，使ER stress減少，從而促使腫瘤細胞抗凋亡作用，但HIF-2α和ADRP二者的關系在人單核巨噬細胞上是否也存在還是未知的。迄今為止，在冠心病患者中HIF-2α和ADRP

6、兩者的表達情況，及兩者的相關性，均未有報道；且HIF-2α在單核細胞中是否對ADRP有調(diào)控作用，并對泡沫細胞的形成產(chǎn)生一定的影響，也是未知的。基于此，在本文中我們將對其進行初步探討及研究，這將有可能為未來動脈粥樣硬化的治療提供一個新的靶點。
　　目的：
　　1. HIF-2α在冠心病患者外周血單核細胞中的表達及其與血管病變嚴重程度的相關性；
　　2. ADRP在冠心病患者外周血單核細胞中的表達情況；
　　3.體外

7、培養(yǎng)并誘導人THP-1單核巨噬細胞后，分析ox-LDL對HIF-2α和ADRP的誘導和表達情況；
　　4.體外培養(yǎng)并誘導人THP-1源性巨噬細胞，利用siRNA技術(shù)沉默HIF-2α后，分析HIF-2α/ADRP通路在泡沫細胞形成過程中的作用。
　　方法：
　　1.選擇2013年5月至2015年1月期間在汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科住院，并行冠脈造影術(shù)檢查的248例患者為研究對象，排除既往有心功能不全病史、肺梗塞

8、、心包炎、心肌炎、心肌病、腦血管病、主動脈夾層、周圍血管病、免疫及結(jié)締組織疾病、急慢性炎癥、貧血、甲亢、發(fā)熱等。依據(jù)冠脈造影結(jié)果，將其分為非冠心病組89例，冠心病患者組159例(其中1支血管病變組69例、2支血管病變組46例、3支血管病變組44例)。同時采用Gensini評分系統(tǒng)對冠心病病變嚴重程度進行評判。
　　2.抽取個體造影前外周血10ml，提取單核細胞，實時熒光定量 RT-PCR測定HIF-2α、ADRP mRNA相對表達

9、量。
　　3.培養(yǎng)人單核細胞株THP-1細胞；加入佛波醇PMA(100 mg/L),誘導其為貼壁的巨噬細胞。再用終濃度為50.0mg/L的ox-LDL作用24h，使之成為泡沫細胞；實時熒光定量RT-PCR及Western blotting檢測HIF-2α及ADRP mRNA及蛋白水平的表達。
　　4.利用RNA干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi），用lipo2000作為介質(zhì)轉(zhuǎn)染單核巨噬細胞后，用實時熒光定量

10、RT-PCR分別檢測HIF-2α及ADRP mRNA表達，用Western blotting檢測HIF-2α及ADRP蛋白表達水平。
　　5.培養(yǎng)誘導人單核巨噬細胞，利用lipo2000轉(zhuǎn)染24h后，加入50.0mg/L ox-LDL作用24h，油紅O(Oil red)及膽固醇檢測試劑盒對細胞內(nèi)脂質(zhì)進行檢測，觀察HIF-2α/ADRP通路對泡沫細胞形成的影響。
　　6.數(shù)據(jù)均釆用?X土 SEM表示，兩組間比較用獨立樣本 t檢

11、驗，多組比較用 One-Way ANOVA(方差齊時多組間多重比較使用 LSD法；方差不齊時，則用Welch法，多重比較用 Tamhane's T2法)，計數(shù)資料采用卡方檢驗，兩個變量間相關關系判斷用spearman相關性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.與對照組相比，HIF-2α mRNA的相對表達量在冠心病患者中高表達，其差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01；且與血管病變嚴重程度正相關；
　　

12、2.與對照組相比，ADRP mRNA的相對表達量在冠心病者中高表達，其差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01；與血管病變程度相關；且與HIF-2α的相對表達量正相關；
　　3. ox-LDL處理組細胞與未處理組相比，HIF-2α、ADRP的mRNA和蛋白水平均高表達(P<0.01)，且隨著作用時間的延長而呈遞增趨勢；
　　4. HIF-2αsiRNA能有效抑制HIF-2α及下調(diào)ADRP的表達(P<0.01)；
　　5.油紅O結(jié)

13、果顯示，siRNA干擾組與陰性對照組相比，細胞內(nèi)脂滴明顯減少；膽固醇檢測結(jié)果示，HIF-2αsiRNA組較陰性對照組相比，細胞內(nèi)膽固醇濃度明顯下降，且有統(tǒng)計學差異（TC:0.057±0.007 vs.0.031±0.03mmol/mg，p<0.05），表明HIF-2αsiRNA能有效抑制單核巨噬源性泡沫細胞的形成。
　　結(jié)論：
　　1. HIF-2α mRNA在冠心病患者中呈高表達趨勢，且與血管病變程度正相關；可作為冠心病的