TNF-α在NK-T細胞淋巴瘤吉西他濱耐藥中作用的研究.pdf

1、背景：
　　淋巴瘤(Lymphoma)是淋巴細胞來源的淋巴造血系統(tǒng)的惡性疾病。依據(jù)腫瘤細胞及組織的病理類型，可主要分為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’slymphoma, HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma,NHL)兩類型。結外NK/T細胞淋巴瘤(extranodal NK/Tcell lymphoma,ENKTCL)作為非霍奇金淋巴瘤的一個特殊的亞型，具有獨特的流行病、病理和臨床特點。其在歐美國家罕

2、見，而在東亞及拉丁美洲常見，中青年男性發(fā)病率高。腫瘤常常累及淋巴結外，鼻咽部常見，其他部位如腭部、扁桃體、咽喉等上呼吸消化道可見，非上呼吸消化道如肺、皮膚、睪丸等罕見。其侵襲性強，病程進展快，預后極差。研究顯示其病因與EB病毒感染相關，國際尚無明確的標準治療方案。常規(guī)非霍奇金淋巴瘤治療方案，如含阿霉素的CHOP方案可使細胞耐藥導致效果不佳，近年來含門冬酰胺酶、吉西他濱等藥物的治療方案展現(xiàn)出一定的效果，但仍有部分患者表現(xiàn)為復發(fā)難治。探索E

3、NKTCL耐藥機制對提高患者療效、改善患者生存具有重要作用，使得對其研究迫在眉睫。
　　近年來，“種子（腫瘤）與土壤（微環(huán)境）”學說愈發(fā)引起關注。微環(huán)境通過與腫瘤細胞的相互作用，促進細胞的增殖、躲避及耐受有害刺激，導致腫瘤的形成和耐藥。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）作為微環(huán)境中細胞因子的重要一員，在腫瘤的形成及抑制中均表現(xiàn)出一定作用。TNF-α是最早發(fā)現(xiàn)的細胞因子，由活化的巨噬細胞分泌

4、產(chǎn)生，在炎癥中發(fā)揮重要作用。目前對于TNF-α的研究多在自身免疫性疾病領域，如類風濕關節(jié)炎、強制性脊柱炎和炎癥性腸病等，針對腫瘤的研究少見。最新研究顯示TNF-α聯(lián)合阿霉素可抵抗乳腺癌耐阿霉素細胞株MCF-7/Adr的耐藥作用，并且提高乳腺癌放化療療效。我們的前期研究證實TNF-α在結外NK/T細胞淋巴瘤患者血清中較正常人明顯降低，提示其可能為ENKTCL的保護性因素。關于TNF-α在ENKTCL耐藥中的作用，尚未有研究報道。NF-κB

5、通路作為近年來研究的熱點通路，其激活與炎癥及腫瘤密切相關，主要通過經(jīng)典途徑和旁路途徑激活NF-κB蛋白，轉入胞核結合靶基因中的啟動子或增強子，誘導相關基因的轉錄和表達，在NK/T細胞淋巴瘤耐藥中可能發(fā)揮著重要的作用。
　　本實驗以NK/T細胞淋巴瘤細胞株YTS為研究對象，采用低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法建立耐吉西他濱（Gemcitabine,Gem）的YTS細胞系（YTS/Gem），在Gem及TNF-α兩因素作用下，分別采

6、用CCK8、細胞流式及Western blot方法對比YTS及YTS/Gem細胞增殖、周期變化及相關蛋白表達情況，初步探索TNF-α在結外NK/T細胞淋巴瘤耐藥中發(fā)揮的作用。
　　目的：
　　以NK/T細胞淋巴瘤細胞株YTS為研究對象，建立耐吉西他濱（Gemcitabine，Gem）的YTS細胞系（YTS/Gem），對比YTS及YTS/Gem在Gem及TNF-α兩因素作用下細胞增殖、周期變化及相關蛋白表達情況，探索TNF-α

7、在結外NK/T淋巴瘤耐藥中作用。
　　方法：
　　1.細胞的體外培養(yǎng)：YTS細胞以1640培養(yǎng)基中加入10％胎牛血清為培養(yǎng)液；YTS/Gem細胞以1640培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清及一定濃度的Gem為培養(yǎng)液。每2-3天對細胞更換或者添加適量培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱，適宜條件（37℃、5％CO2）下培養(yǎng)。
　　2.YTS/Gem細胞的構建：對YTS細胞使用Gem低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法誘導其產(chǎn)生耐藥，建立可穩(wěn)定傳代

8、的耐Gem的 YTS細胞株（YTS/Gem）。
　　3.耐藥指數(shù)的測定：在96孔板中以不同濃度Gem（0、5、10、20、40、80nM）處理YTS細胞和YTS/Gem細胞，設3個復孔；采用CCK8法，利用酶標儀測定波長在450nm時的吸光度，獲得相應OD值，計算YTS細胞和YTS/Gem細胞的IC50值，重復測量三次，求得YTS/Gem細胞的耐藥指數(shù)。
　　4.實驗分組：對YTS、YTS/Gem細胞，分別進行如下實驗分組：

9、
　?、賹φ战M：將YTS細胞或YTS/Gem細胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h；
　?、赥NF-α組：將YTS細胞或YTS/Gem細胞在含TNF-α20ng/ml濃度培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h；
　　③Gem組：將YTS細胞或 YTS/Gem細胞分別在含 Gem20nM濃度培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h；
　　④Gem+TNF-α組：將YTS細胞或YTS/Gem細胞在含TNF-α20ng/ml濃度及Gem20nM濃度培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h。

10、>　　5.細胞增殖的檢測：采用CCK8法，在96孔板分設3個復孔，利用酶標儀測定波長在450nm時的吸光度，獲得相應OD值，比較YTS細胞及YTS/Gem細胞在TNF-α組、Gem組及Gem+TNF-α組增殖活性的改變。
　　6.Western blot法檢測相關蛋白：對YTS和YTS/Gem細胞的對照組、TNF-α組、Gem組及Gem+TNF-α組分別檢測NF-κB通路中磷酸化NF-κB（p-p65）蛋白、總NF-κB（p65）

11、蛋白表達情況。
　　7.流式細胞技術檢測細胞周期：對YTS/Gem細胞，使用流式細胞技術（flow cytometry，F(xiàn)CM）比較TNF-α組、Gem組及Gem+TNF-α組細胞周期的改變。
　　8.使用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析和繪圖，數(shù)據(jù)均用平均值±標準差（x?s）顯示。兩組不同數(shù)據(jù)比較如果其方差齊，使用t檢驗，如方差不齊，使用t’檢驗。多組不同數(shù)據(jù)間的比較即選取單因素方差方法分析，多樣本不同均數(shù)其兩兩比較即采

12、用LSD-t檢驗。p<0.05表示差異具有顯著的統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.成功構建了NK/T細胞淋巴瘤細胞的吉西他濱耐藥株YTS/Gem。吉西他濱對YTS細胞和YTS/Gem細胞的IC50值分別為（18.09±1.67）nM和（314.90±5.62）nM，YTS/Gem細胞株耐藥指數(shù)達到了17.41。
　　2.TNF-α促進YTS/Gem細胞的增殖：
　?。?）在TNF-α作用下，TNF-α組與對照組相

13、比，TNF-α對YTS細胞作用不明顯（p>0.05），卻使YTS/Gem細胞存活率提高（p<0.05）。
　?。?）在TNF-α與Gem作用下，Gem+TNF-α組與Gem組相比， TNF-α對YTS細胞作用不明顯（p>0.05），卻使YTS/Gem細胞存活率提高（p<0.05）。
　　3.TNF-α使YTS/Gem細胞的NF-κB通路激活：在YTS/Gem細胞中，TNF-α組與對照組相比，TNF-α使磷酸化NF-κB（p-

14、p65）蛋白表達增高，而總NF-κB（p65）蛋白表達無明顯變化；Gem+TNF-α組與Gem組相比，TNF-α使磷酸化NF-κB（p-p65）蛋白表達增高，而總NF-κB（p65）蛋白表達無明顯變化。
　　4.TNF-α對YTS/Gem細胞周期無影響：在YTS/Gem細胞中：TNF-α組與對照組相比，TNF-α使 G0/G1期細胞比例減少、S期細胞比例增多，差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)；Gem+TNF-α組與Gem組相比，T