GR通過(guò)DEC1影響神經(jīng)細(xì)胞分化及其自身調(diào)節(jié)機(jī)制在ADHD大鼠中的研究.pdf

1、目的：比較WKY和SHR大鼠前額皮質(zhì)區(qū)(Prefrontal Cortex，PFC)以及PC12H和PC12L細(xì)胞中GR和DEC1的蛋白表達(dá)差異。檢測(cè)GR和DEC1對(duì)PC12細(xì)胞分化的調(diào)控。研究GR通過(guò)調(diào)節(jié)DEC1在ADHD中的作用機(jī)制。探討GR受調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法：
　　1.通過(guò)Western blot驗(yàn)證WKY和SHR大鼠PFC區(qū)的GR、DEC1蛋白表達(dá)差異。
　　2.通過(guò)Western blot驗(yàn)證PC12H、

2、PC12L細(xì)胞的GR、DEC1蛋白表達(dá)差異。
　　3.構(gòu)建GR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、GR干擾質(zhì)粒，通過(guò)Western blot驗(yàn)證已構(gòu)建質(zhì)粒的有效性，分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PC12H、PC12L細(xì)胞，觀察、記錄并分析PC12細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　4.通過(guò)免疫共沉淀法驗(yàn)證WKY和SHR大鼠腦組織中GR和DEC1的相關(guān)性。
　　5.通過(guò)Western blot驗(yàn)證已構(gòu)建質(zhì)粒的有效性。DEC1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PC12H細(xì)胞，siDEC1處理P

3、C12L細(xì)胞，觀察、記錄并分析PC12細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　6.通過(guò)免疫共沉淀法檢測(cè)GR在SHR和WKY大鼠PFC磷酸化水平的表達(dá)差異。
　　7.通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)工具NetPhos2.0 Server及網(wǎng)站PhosphoSitePlus預(yù)測(cè)GR的潛在酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1.GR和DEC1在SHR大鼠PFC區(qū)的蛋白表達(dá)均比WKY大鼠升高。
　　2.GR在PC12H細(xì)胞相對(duì)低表達(dá)，而PC12L細(xì)胞相對(duì)

4、高表達(dá)，DEC1在兩種不同分化程度的細(xì)胞上的表達(dá)差異與GR有相同趨勢(shì)。
　　3.在PC12L、PC12H細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GR干擾質(zhì)粒及GR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，其蛋白水平出現(xiàn)明顯下降或升高，且GR干擾后的第2天起，PC12L細(xì)胞出現(xiàn)神經(jīng)突增生，表現(xiàn)為神經(jīng)突長(zhǎng)度增加及含有3個(gè)及三個(gè)以上神經(jīng)突的細(xì)胞百分比的增加，且隨時(shí)間變化神經(jīng)突長(zhǎng)度呈遞增趨勢(shì)。已驗(yàn)證有效性的GR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒在PC12H細(xì)胞轉(zhuǎn)染后使細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)受到抑制，其形態(tài)變化與GR干擾后的P

5、C12L細(xì)胞呈相反趨勢(shì)。
　　4.將腦組織裂解液用GR抗體免疫沉淀后的復(fù)合物中，DEC1蛋白也能表達(dá)，同時(shí)，用DEC1抗體免疫沉淀腦組織裂解液，發(fā)現(xiàn)GR蛋白也能表達(dá)。
　　5.在PC12L、PC12H細(xì)胞中用siDEC1處理或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染DEC1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，其蛋白水平出現(xiàn)明顯下降或升高，且PC12L細(xì)胞經(jīng)DEC1干擾后出現(xiàn)神經(jīng)突增生，表現(xiàn)為神經(jīng)突長(zhǎng)度從第2天開(kāi)始明顯伸長(zhǎng)，但含有3個(gè)及以上神經(jīng)突的細(xì)胞所占比例是從第4天開(kāi)始出現(xiàn)明顯

6、增加，且均隨時(shí)間變化呈遞增趨勢(shì);已驗(yàn)證有效性的DEC1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒在PC12H細(xì)胞轉(zhuǎn)染后使細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)受到抑制，其形態(tài)變化與GR干擾后的PC12L細(xì)胞呈相反趨勢(shì)。
　　6.在免疫熒光圖中可見(jiàn)DEC1過(guò)表達(dá)的PC12H細(xì)胞中神經(jīng)突標(biāo)志物——Tau、GAP-43和MAP-2的熒光值較空白對(duì)照組升高。
　　7.SHR大鼠的PFC區(qū)中GR的磷酸化水平較WKY大鼠升高，特別是酪氨酸磷酸化水平，DEC1的酪氨酸磷酸化水平無(wú)明顯差異，但其

7、在SHR大鼠PFC中絲氨酸磷酸化水平較WKY大鼠升高。
　　8.GR第226位絲氨酸磷酸化水平在SHR和WKY大鼠大PFC無(wú)明顯差異，而GR第211位絲氨酸磷酸化水平在SHR大鼠表達(dá)較高。
　　9.GR潛在的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)可能有Y31、Y109、Y124、Y321、Y353等。
　　結(jié)論：
　　1.GR和DEC1在ADHD大鼠前額區(qū)表達(dá)水平升高。
　　2.GR和DEC1均能抑制PC12細(xì)胞分化，并且有時(shí)間