轉錄因子RBP-J通過介導Notch信號調控神經細胞分化.pdf

1、中樞神經系統發(fā)育是脊椎動物胚胎發(fā)育過程中調控最復雜、次序最嚴謹的事件之一。胚胎神經管中的神經干細胞（neuralstemcells，NSCs）是一種維持自我更新的多潛能細胞，可以進一步分化為各種不同類型的神經細胞。在神經發(fā)育過程中，NSCs隨著發(fā)育階段的不同變換著它們的響應性和發(fā)育潛能。在早期擴增階段，神經干細胞主要進行廣泛的增殖來擴大細胞群體。隨著發(fā)育的進行，一些神經干細胞在區(qū)域性神經誘導信號的作用下起始了原神經基因（proneura

2、lgene）的表達。Proneuralgenes是一類堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（basichelix-loop-helix,bHLH）轉錄因子，如Mash1、Ngn1/2和Math1等，它們可以誘導神經元特異性基因的表達，從而將多潛能的神經干細胞決定到神經元分化命運上來。隨著proneural基因的表達，神經管中原本相對均一的NSCs群體開始形成差異。那些起始表達proneural基因的NSCs分化為神經元前體細胞，而未表達proneura

3、l基因的細胞仍然維持干細胞狀態(tài)。隨后，神經元前體細胞開始退出細胞周期，遷移至神經管外側并分化為神經元。而NSCs仍然維持未分化狀態(tài)直到神經發(fā)生晚期，再在特定神經誘導信號的作用下分化為晚期的神經細胞類型，比如膠質細胞。維持一個適當規(guī)模的NSCs群體對于神經發(fā)育的正常進行至關重要，如果NSCs提前分化則會導致嚴重的神經系統發(fā)育缺陷。由于NSCs沒有得到充分的擴增，會最終導致神經細胞總量的下降。同時，NSCs提前分化只產生早期的神經細胞類型，

4、從而導致晚期神經細胞類型的缺失，因而不能建立正常的中樞神經系統。除此以外，由于NSCs強大的分化潛能和自我更新能力，在醫(yī)學上還具有治療神經損傷和神經退行性變等疾病的潛能。
　　視網膜是研究神經干細胞/神經前體細胞（Neuralprogenitorcells,NPCs）增殖分化的優(yōu)異模型。在神經發(fā)育早期，視網膜由間腦的神經上皮向兩側形成突起發(fā)育而來，是中樞神經系統地一部分。在哺乳類神經發(fā)育過程中，視網膜前體細胞（Retinalpro

5、genitorcells,RPCs）可以分化形成視網膜中的7種主要神經細胞類型，這些不同的細胞類型在視網膜神經上皮增殖的同時依次分化出現：神經節(jié)細胞、視錐細胞及水平細胞最先生成，接著是無長突細胞和視桿細胞，最后才是雙極細胞和Müller氏膠質細胞。分化中的神經細胞要遷移到適當的位置，以形成正確的細胞排列，并最終形成視網膜的五個組織層次，包括三個有核層(nuclearlayers)及將它們聯系在一起的兩個突觸層(synapticlayer

6、s)，從而完成光信號的接受、轉換和傳導。視網膜豐富的細胞類型和規(guī)則的層次結構，是視覺功能實現的生物基礎。
　　與視網膜相同，小腦(cerebellem)特別是小腦皮層是中樞神經系統最為高度有序的結構之一。與大腦皮層相比，它的特征性和簡單性使其成為研究中樞神經系統發(fā)育機制的又一經典模型。發(fā)育中過程中，由小腦室區(qū)和菱腦唇兩個生發(fā)中心分化出九型神經細胞：包括浦肯野(氏)細胞、高爾基細胞、顆粒細胞、籃狀細胞、星形細胞和Lugaro細胞，單

7、極刷(形)細胞，和燭臺（狀）細胞，以及小腦特異性的Bergmann(氏)膠質細胞。成熟的小腦皮層由這八型神經元和一型膠質細胞排列成精確的立體結構，并形成復雜的神經環(huán)路從而實現運動協調、技能學習等重要的生理功能。
　　在神經發(fā)育過程中，NSC/NPCs的增殖和分化受到多個信號轉導途徑的精確調控。以細胞膜受體Notch、轉錄因子RBP-J及其下游效應基因組成的Notch信號途徑是調控發(fā)育過程的基本信號之一。雖然既往研究揭示出Notch

8、途徑在神經細胞分化中發(fā)揮重要的調控作用，但操作Notch途徑不同分子得到的實驗結果具有差別，其發(fā)揮作用的下游靶點也存在爭議。基于干預單個Notch受體或其下游基因的研究方法，不足以反映Notch信號功能的全貌。由于在哺乳動物中，Rbpj編碼的轉錄因子可以整合并傳遞來源于四型Notch受體的信號，從而激活下游基因轉錄。因此在本課題研究中，我們利用Cre-Loxp重組酶系統，在小鼠RPCs和小腦原基的NPCs中特異性剔除Rbpj基因。

9、>　　Rbpj敲除視網膜與野生型小鼠視網膜相比，出現明顯的發(fā)育障礙和視網膜層次結構異常。視網膜發(fā)育早期，RPCs分化加速，表現為一系列proneural基因表達上調。然而，僅有神經節(jié)細胞和感光細胞增多，中間神經元數目減少，提示RBP-J缺失導致神經元提前分化和RPCs的耗竭；發(fā)育晚期，通過活體電穿孔在出生后小鼠視網膜中敲除Rbpj主要導致視桿細胞增加和Müller氏膠質細胞減少。提示RBP-J參與調控感光細胞和Müller氏膠質細胞的定

10、向分化。此外，在Rbpj缺失的視網膜中，層狀結構的紊亂伴隨著視網膜外表面細胞粘附相關分子β-catenin的表達缺失。更為有趣的是，我們通過活體電穿孔在Rbpj缺失的視網膜中過表達β-catenin，觀察到視網膜正常層次結構的恢復。
　　Rbpj敲除小腦與野生型小鼠小腦相比體積顯著變小，分葉結構消失。發(fā)育早期（E10.5、E12.5）小腦原基腦室區(qū)proneural基因Mash1表達上調，神經元提前分化，增殖的NPCs顯著減少，表

11、明Notch-RBP-J信號途徑維持著小腦原基中NPCs的數量，并控制著小腦神經細胞分化的時程。發(fā)育晚期浦肯野細胞和顆粒細胞持續(xù)性減少，小腦深部核團幾乎消失。此外，Rbpj敲除小鼠中決定菱腦峽組織者（IsthmicOrganizer）建立和中后腦分界形成的重要因子在相應區(qū)域均有表達，表明Rbpj表達失活對于IO的形成沒有顯著性影響，同時說明Notch-RBP-J信號途徑對于小腦原基發(fā)育的調控作用是直接的，而并非間接的通過調節(jié)IO建立而發(fā)

12、揮影響。
　　上述研究結果共同揭示RBP-J所介導的經典Notch信號途徑通過抑制神經細胞分化(differentiation)，從而維持足夠的NSC/NPCs直至晚期發(fā)育；此外，Notch-RBP-J信號也參與神經細胞定向（specification），發(fā)揮諸如抑制視網膜感光細胞分化，以及促進Müller氏膠質細胞形成的作用；在形態(tài)發(fā)生方面，RBP-J還可能通過調控粘附相關分子β-catenin的表達參與視網膜層次結構形成；同時

13、，我們的研究證明RBP-J對于中后腦分界的形成沒有顯著影響。綜上所述，本課題的研究結果發(fā)現，轉錄因子RBP-J通過介導經典Notch信號途徑調控神經細胞的定向、分化；并在特定發(fā)育環(huán)境中調節(jié)神經系統形態(tài)形成，從而協調神經發(fā)生（Neurogenesis）和形態(tài)形成（Morphogenesis）兩個發(fā)育過程，最終確保神經系統正常的結構形成及功能建立。這些研究對于深入理解神經發(fā)育過程中的分子機理以及Notch信號全面的調控作用，以及了解相關人類