音猬因子方案定向誘導人骨髓基質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞的研究.pdf

1、隨著工業(yè)文明的快速發(fā)展，外傷性脊髓損傷患者的數(shù)量日漸增多，但脊髓損傷的治療卻一直是現(xiàn)代醫(yī)學的難題，世界各地的醫(yī)務工作者都在積極探索有效的治療方法。近年來隨著組織工程研究的興起，使用干細胞組織工程技術治療脊髓損傷受到了極大關注，為修復脊髓損傷提供了新的途徑。其中種子細胞的選擇與獲取是神經(jīng)組織工程研究的基礎和熱點。目前研究較多的種子細胞有神經(jīng)干細胞、胚胎干細胞、骨髓基質(zhì)干細胞、雪旺細胞及嗅鞘細胞等。干細胞由于具有高度的自我更新與多向分化潛能

2、，成為組織工程研究中重要的靶器官。骨髓基質(zhì)干細胞是骨髓中的非生血干細胞，其起源于中胚層未分化的間充質(zhì)細胞。由于具有取材便利，來源豐富，易于擴增分離，具有向多種中胚層和神經(jīng)外胚層細胞分化的能力，且分化后回輸自體時不存在免疫排斥及倫理學束縛等特點，成為最具潛力的種子細胞。 本實驗應用密度梯度離心法分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細胞，研究其生物學特性，采用全反式維甲酸、音猬因子和堿性成纖維生長因子8 的不同組合方案誘導骨髓基質(zhì)干細胞定向分化為神經(jīng)

3、細胞，并進一步研究不同組合對細胞數(shù)量和活性的影響，尋找骨髓基質(zhì)干細胞定向分化為神經(jīng)細胞的最佳方案，為神經(jīng)組織工程提供充足、穩(wěn)定的細胞來源。 實驗第一部分應用密度梯度離心法分離骨髓基質(zhì)干細胞，培養(yǎng)并傳代觀察。研究并記錄其生長特性和生物學特點；根據(jù)傳代（P5）后細胞的形態(tài)學特征和成骨特性對分離、培養(yǎng)、傳代后的骨髓基質(zhì)干細胞綜合鑒定。 結(jié)果證實： 1．實驗應用密度梯度離心法分離人骨髓基質(zhì)干細胞，方法簡便，成本低廉，原代

4、培養(yǎng)成功率高達100％，所獲取細胞48h 貼壁率高、生長穩(wěn)定、增殖速度快、形態(tài)較為均一。證實本實驗方法可以穩(wěn)定獲取和擴增人骨髓基質(zhì)干細胞。 2．根據(jù)細胞的形態(tài)學特征、表面特異性抗原和成骨特性對傳代（P5）后細胞進行綜合鑒定，發(fā)現(xiàn)所獲取細胞外部形態(tài)上都成紡錘形或星形成纖維細胞狀，形態(tài)較為均一；具有公認的骨髓基質(zhì)干細胞相對特異性抗原；可以穩(wěn)定誘導分化為骨細胞，證實所獲取細胞為具有多向分化潛能的骨髓基質(zhì)干細胞。 實驗第二部分為

5、采用全反式維甲酸、音猬因子和堿性成纖維生長因子8的不同組合方案誘導骨髓基質(zhì)干細胞定向分化為神經(jīng)細胞，并進一步研究不同組合對細胞數(shù)量和活性的影響，尋找骨髓基質(zhì)干細胞定向分化為神經(jīng)細胞的最佳方案。 結(jié)果證實： 1．體外使用音猬因子（sonic hedgehog,SHH）可以誘導人骨髓基質(zhì)干細胞（BMSCs）分化為神經(jīng)元樣細胞（神經(jīng)干細胞、神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞），且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴效應。C 組組合（SHH 500n

6、g/ml,FGF-8 100ng/ml）為最佳誘導濃度，以較低濃度的誘導劑誘導產(chǎn)生的神經(jīng)樣細胞最多。且音猬因子可以促進細胞增殖，提高細胞成活率。 2．使用SHH 聯(lián)合RA 共同模擬胚胎發(fā)育過程中的體內(nèi)環(huán)境來誘導BMSCs定向分化為神經(jīng)元細胞，這種組合方法可以進一步提高誘導效率，并降低RA對細胞的毒性，提高細胞成活率。 本實驗成功、穩(wěn)定的獲取了人骨髓基質(zhì)干細胞，并對其生物學特征進行了初步分析、鑒定。應用音猬因子及音猬因子與