新型siRNA表達(dá)載體、隨機(jī)siRNA文庫(kù)的構(gòu)建及基于隨機(jī)siRNA文庫(kù)的細(xì)胞增殖相關(guān)基因篩選.pdf

1、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文新型siRNA表達(dá)載體、隨機(jī)siRNA文庫(kù)的構(gòu)建及基于隨機(jī)siRNA文庫(kù)的細(xì)胞增殖相關(guān)基因篩選姓名：張麗姝申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：沈巖梁子才20050501!璺!!塑墾型至堂豎主堡莖!蘭塑塞DNA。我們選擇化學(xué)合成質(zhì)量符合要求的隨機(jī)序列大量克隆到載體，構(gòu)建了siRNA瞬時(shí)表達(dá)文庫(kù)pBUH—RSL。pBUH_RSL文庫(kù)的獨(dú)立克隆數(shù)為5107；其中有效克隆占‘90％：隨

2、機(jī)siRNA編碼區(qū)的GC含量40％。在此基礎(chǔ)上我們用轉(zhuǎn)移pBUtIRSL文庫(kù)編碼框的方法構(gòu)建了一個(gè)真核穩(wěn)定表達(dá)siRNA文庫(kù)pCUH，文庫(kù)的獨(dú)立克隆_RSL數(shù)為1108，有效克隆98％，小量測(cè)序未發(fā)現(xiàn)文庫(kù)序列多拷貝重復(fù)的情況。我們用pCUH文庫(kù)進(jìn)行了細(xì)胞增殖相關(guān)基因的篩選研究。文庫(kù)_RSLpCUHRSL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MC3T3El細(xì)胞，在G418的選擇壓力F傳代培養(yǎng)60天。這樣，因表達(dá)某種siRNA而獲得增殖加快表型的細(xì)胞會(huì)在連續(xù)的細(xì)胞傳代過(guò)

3、程中逐漸得到富集。收集篩選結(jié)束時(shí)的細(xì)胞，此時(shí)轉(zhuǎn)染文庫(kù)組細(xì)胞的增殖速度明最快于陰性對(duì)照細(xì)胞，提示文庫(kù)中的某些成員的確起到了促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。通過(guò)PCR／克?。瘻y(cè)序的方法獲知這些細(xì)胞中所轉(zhuǎn)染的siRNA序列。當(dāng)表達(dá)這些siRNA的pCUH質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)染MC3T3E1細(xì)胞，一些siRNA再次明顯的促進(jìn)了細(xì)胞增殖，如cloneB7，B38，A66，B13等。進(jìn)一步的驗(yàn)證及這些siRNA預(yù)計(jì)靶基因的功能研究工作正在進(jìn)行中。相向雙啟動(dòng)子模式的siI

4、NA表達(dá)框是siRNA表達(dá)框方式上的新突破，我們構(gòu)建的基于HI／U6相向雙啟動(dòng)子表達(dá)框的質(zhì)粒pBUH、pCUH、pEGUH具有優(yōu)于現(xiàn)有短發(fā)夾型siRNA表達(dá)載體的特性，如，連接效率高、穩(wěn)定、測(cè)序無(wú)障礙等，最重要的，用這類siRNA表達(dá)載體可以很簡(jiǎn)便地構(gòu)建各種siRNA文庫(kù)。我們成功構(gòu)建了5lO7的隨機(jī)siRNA文庫(kù)，是這一類型的siRNA文庫(kù)的首次報(bào)道。用這一文庫(kù)進(jìn)行的增殖基因篩選工作己初步顯示了這種文庫(kù)在基因功能研究中的良好應(yīng)用潛能。