PIM1激酶線性泛素化修飾及其功能研究.pdf

1、蛋白激酶PIM是絲/蘇氨酸激酶家族的重要組成部分，包括PIM1、PIM2、PIM3三個成員，該家族蛋白氨基酸序列同源性很高，功能相近，但其分布具有組織特異性。PIM基因發(fā)揮多方面的生物學功能，包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細胞周期、細胞凋亡、細胞代謝、細胞自噬、胚胎干細胞干性維持等多個方面。目前發(fā)現(xiàn)PIM家族在多種惡性腫瘤中高表達并在腫瘤形成和轉移中發(fā)揮重要功能，已成為抗腫瘤藥物的新靶點。在PIM蛋白家族的三個成員中，尤以PIM1的功能研究最為廣

2、泛，該分子首次被發(fā)現(xiàn)時定義為鼠的白血病前病毒插入位點，它編碼34KD和44KD兩個亞型的蛋白。PIM1蛋白是一個刺激反應性蛋白，其表達水平受多種因素誘導，例如:GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-5、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、EPO、PMA、干擾素γ等均可誘導其高表達。PIM1蛋白通過磷酸化不同的底物蛋白從而參與腫瘤發(fā)生、細胞周期、細胞凋亡等多方面功能。在腫瘤發(fā)生發(fā)展方面，重要的信號通路Jak-STAT和NF-κB

3、通過促進PIM1基因轉錄，從而上調PIM1的表達水平，另一方面，高表達的PIM1蛋白又能夠負反饋調節(jié)這兩條信號通路抑制其持續(xù)激活。細胞周期方面，PIM1可在不同時期通過磷酸化檢查點蛋白Cdc25A或者Cdc25C影響細胞周期的進程，促進細胞周期G1/S或G2/M檢查點的轉換;另外PIM1還可通過磷酸化激酶CDK的抑制分子p27Kip1，促進p27降解，進而加速細胞周期進程。細胞凋亡方面，PIM1通過磷酸化促凋亡蛋白BAD引發(fā)BAD蛋白的

4、降解，從而抑制細胞凋亡并提高細胞存活能力。美國圣地亞哥大學Mark Sussman等研究證明，PIM1可以通過磷酸化線粒體膜蛋白Drp1從而抑制其線粒體轉位，保護心肌細胞免受死亡，PIM1已成為缺血性心肌損傷治療的新靶點。
　　泛素化修飾是一種重要的蛋白質翻譯后修飾方式，它參與調控細胞的周期進程、基因轉錄、DNA修復、信號傳導等多個方面。已知的泛素化修飾包括單泛素化和多泛素化兩種類型，關于它們的生物學功能目前已被廣泛研究。近年來國

5、際上報導了一種全新的泛素化修飾形式—線性泛素化，它是將泛素以首尾相連的方式共價結合到底物蛋白分子的賴氨酸殘基上，完成對底物蛋白的修飾。2009年日本科學家Kazuhiro Iwai首次報道NF-κB信號通路中IKK復合物的成員NEMO能夠發(fā)生線性泛素化修飾，這種修飾會改變NEMO自身構象，增強IKK復合體的穩(wěn)定性，進而促進NF-κB信號通路的激活。NEMO是已知能夠發(fā)生線性泛素化修飾的蛋白分子，其分子結構特點是含有一個親和線性泛素化鏈的

6、UBAN結構域，該結構域能夠招募線性泛素化鏈，從而使NEMO分子發(fā)生聚合。本項研究以線性泛素化修飾作為切入點，希望發(fā)現(xiàn)新的線性泛素化底物分子，并研究其生物學功能。
　　我們利用UBAN結構域的特殊氨基酸序列進行生物信息學分析，篩選到若干潛在的能夠發(fā)生線性泛素化修飾的蛋白分子，其中PIM1蛋白是底物候選分子之一。近年來關于PIM1功能研究的報道很多，其發(fā)揮生物學作用依賴于絲/蘇氨酸激酶活性，科學家們一直致力于研究激酶PIM1的小分子

7、抑制劑作為抗腫瘤藥物，因此PIM1激酶活性的調控成為研究重點。文獻報道PIM1激酶活性主要受其表達水平和穩(wěn)定性的調控，它通常是以泛素—蛋白酶體途徑降解從而影響穩(wěn)定性，那么PIM1蛋白能否通過線性泛素化修飾機制調控其激酶活性有待于深入研究。本項研究我們通過泛素化實驗驗證PIM1蛋白分子能夠發(fā)生線性泛素化修飾，并進一步探討了這種特殊翻譯后修飾的生物學功能。
　　首先我們通過PCR技術在體外擴增獲得PIM1基因片段，經過HindⅢ和Ec

8、oRⅠ兩種限制性核酸內切酶酶切得到具有相同酶切位點的PIM1基因片段和pcDNA3.0載體片段，利用T4 DNA連接酶將PIM1基因片段插入載體中，構建表達良好的Flag-PIM1質粒，為后續(xù)驗證實驗奠定良好基礎。在HEK293T細胞中過表達線性泛素化E3酶HOIP、HOIL-1L、SHARPIN及Flag-PIM1質粒，通過免疫沉淀（IP）方法富集PIM1蛋白，利用線性泛素化抗體免疫印跡發(fā)現(xiàn)過表達E3酶后，PIM1發(fā)生明顯的線性泛素化

9、修飾現(xiàn)象，而陰性對照組不能觀察到該現(xiàn)象，說明PIM1蛋白在過表達體系下能夠發(fā)生線性泛素化修飾。為了進一步確認這一現(xiàn)象并鑒定線性泛素化修飾的賴氨酸殘基位點，我們在HEK293T細胞中過表達PIM1及線性泛素化E3酶和泛素Ubiquitin，通過IP手段富集線性泛素化修飾的PIM1蛋白分子，經過蛋白洗脫，超濾等過程，制備PIM1蛋白樣品并進行質譜鑒定。質譜分析結果顯示PIM1蛋白酶解的肽段中含有氨基酸序列為GGMQIF（G-甘氨酸，M-甲硫

10、氨酸，Q-谷氨酰胺，I-異亮氨酸，F(xiàn)-苯丙氨酸）的多肽片段，此序列為線性泛素化鏈的特征序列，證明了PIM1線性泛素化修飾的存在。此外，質譜分析結果提示K67和K169賴氨酸位點可能作為線性泛素化修飾的位點，因此進一步研究擬構建這兩個位點的突變體，通過泛素化實驗驗證它們是否為線性泛素化修飾位點。
　　PIM1蛋白在細胞內發(fā)揮的重要生物學功能依賴于其對眾多底物蛋白的磷酸化修飾，因此我們利用體外激酶實驗研究PIM1線性泛素化修飾是否影響

11、了它的激酶活性。在激酶反應體系中，加入純化的組蛋白H3作為PIM1激酶底物、能量ATP、激酶PIM1，以激酶Aurora磷酸化組蛋白H3作為實驗體系的陽性對照。體外激酶實驗結果顯示，與未修飾PIM1對照組相比，線性泛素化修飾PIM1導致的組蛋白H3磷酸化水平明顯降低，說明PIM1線性泛素化修飾能夠抑制其激酶活性。
　　綜上，我們發(fā)現(xiàn)了PIM1蛋白一種新的翻譯后修飾方式—線性泛素化修飾，并利用質譜方法鑒定了潛在的線性泛素化修飾賴氨酸