抑癌基因Arid2調(diào)控肝癌細胞的增殖及相關(guān)分子機制.pdf

1、目的：Arid2是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，定位于第12對染色體的長臂，包含21個外顯子。Arid2是SWI/SNF復(fù)合物的一種特有亞基，而該復(fù)合物是一種依賴ATP酶的染色質(zhì)重塑復(fù)合物，可以通過水解ATP獲得的能量，改變組蛋白與核小體之間的相互作用進而改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化過程。人類Arid家族包含15個成員，可分為七個亞家族：Arid1~5，JArid1和JArid2。近年的研究表明Arid2等組成的

2、蛋白復(fù)合物SWI/SNF具有腫瘤抑制作用，其可能的途徑如下：1）通過調(diào)控IFN信號通路調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答；2）通過Rb-E2F信號通路調(diào)控細胞的增殖；3）調(diào)控細胞骨架蛋白、跨膜糖蛋白如ROCK1和CD44的表達參與調(diào)控細胞的遷移與侵襲力。
　　Arid家族的突變失活與人類多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，黑色素瘤，非小細胞型肺癌以及頭頸部癌等。在丙型肝炎病毒(HCV)

3、感染相關(guān)的HCC中，約18.2％的HCC組織標本存在Arid2的失活突變。
　　此外，Arid2還可以影響早期發(fā)育，在胚胎形成階段Arid2的突變可以導(dǎo)致多種心臟缺陷包括室間隔缺損、完全性房室間隔缺損等。但到目前為止，Arid2基因的生物學(xué)功能尚不明確，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展特別是肝細胞肝癌中的作用仍知之甚少。因此本研究擬在體外肝癌細胞中觀察抑癌基因Arid2對細胞生物學(xué)功能的影響，并在荷瘤鼠模型中觀察Arid2對于體內(nèi)成瘤的影響，并探

4、索Arid2在腫瘤發(fā)生中所起的作用及其相關(guān)分子機制。
　　方法：RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測人肝癌組織標本和不同的肝癌細胞中Arid2基因的表達情況；構(gòu)建沉默Arid2和過表達Arid2的重組腺病毒，通過 MTS及 Transwell實驗觀察給予 siArid2及過表達Arid2處理后肝癌細胞增殖、遷移能力的改變；流式細胞術(shù)檢測 Arid2對于肝癌細胞周期的影響；進一步通過荷瘤鼠實驗觀察Arid2對于體內(nèi)腫瘤生長

5、轉(zhuǎn)移的影響，免疫組化檢測裸鼠移植瘤中c-myc、β-catenin、ki-67及cyclinD1的表達，驗證體外細胞模型的實驗結(jié)果；并運用熒光定量PCR和Western blot技術(shù)分別檢測給予沉默Arid2和過表達Arid2后Rb-E2F信號通路上下游信號分子的表達變化，IP實驗觀察Arid2與轉(zhuǎn)錄因子E2F1、E2F4是否具有直接的相互作用，并通過ChIP研究Arid2參與細胞周期調(diào)控的可能分子機制。
　　結(jié)果：RT-PCR及

6、Western blot均證實，腫瘤組織中Arid2的表達明顯低于癌旁組織，在呈現(xiàn)明顯的低表達。細胞功能學(xué)實驗顯示，沉默Arid2可以促進細胞增殖、遷移及細胞周期由G1期向S期的轉(zhuǎn)換，反之給予過表達Arid2處理后，細胞增殖及遷移受到明顯的抑制，細胞停滯在G1期。
　　荷瘤鼠皮下成瘤及肝臟原位成瘤實驗發(fā)現(xiàn)，過表達Arid2可以明顯延緩體內(nèi)腫瘤的形成速度，抑制腫瘤的成瘤率及生長速度，同時還能抑制相關(guān)基因如 ki-67、c-myc、β

7、-catenin以及細胞周期蛋白 cyclinD1的表達。沉默Arid2則能明顯促進移植瘤的生長和大小，上調(diào)上述細胞增殖及侵襲指標分子的表達。
　　Western blot和熒光定量PCR實驗顯示，Arid2可以下調(diào)Rb-E2F通路重要分子如pRb、E2F1、cyclinD1、cyclinE1的表達，IP實驗發(fā)現(xiàn)Arid2蛋白可以與E2F1、E2F4直接結(jié)合，ChIP實驗表明，Arid2可以抑制E2F1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物在下游靶基因啟動子

8、區(qū)的募集，同時增強 E2F4復(fù)合物在上述區(qū)域的富集。
　　結(jié)論：Arid2可以抑制腫瘤細胞的增殖以及腫瘤的生長，其機制可能是調(diào)控細胞周期的進程，抑制細胞進入分裂期，具體調(diào)控的方式：1）抑制激活性轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達并促進阻滯性轉(zhuǎn)錄因子E2F4的表達；2）抑制E2F1-pRb募集到下游靶基因啟動子區(qū)，同時促進E2F4-p130在靶基因啟動子區(qū)的結(jié)合；3）抑制細胞周期蛋白 cyclinD1、cyclinE1的表達。本實驗闡明了Ari