肝癌基因差異表達(dá)譜的篩選及EIF3B對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、研究背景與目的:肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全世界第二大癌癥致死的主要疾病,其中有一半的肝癌診斷和死亡發(fā)生在我國。研究證實(shí)肝癌的發(fā)生、發(fā)展是多步驟的,很多異常表達(dá)的基因在影響肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的過程中起了關(guān)鍵作用,這些基因參與細(xì)胞生命進(jìn)程的各個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié),如細(xì)胞周期的控制,細(xì)胞生長、凋亡及細(xì)胞的遷移和擴(kuò)散。針對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展,篩選鑒定與肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的分子靶標(biāo)將可能為臨床上肝癌患者開發(fā)潛在的

2、治療靶點(diǎn)。近幾年,cDNA微陣列(基因芯片)技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展,為在全基因組內(nèi)尋找與腫瘤等疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的差異性表達(dá)的基因提供了一個(gè)強(qiáng)有力的手段。在本研究中,我們將使用Affymetrix公司的 Human Geome U133 plus2.0基因表達(dá)譜芯片在人類全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)、比較肝癌患者腫瘤組織及癌旁正常肝組織基因表達(dá)譜的差異,獲得二者的差異表達(dá)基因,利用生物信息學(xué)的初步挖掘,篩選出有關(guān)的功能基因作為潛在的分子靶標(biāo),從而獲得更

3、多與肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)化相關(guān)的分子機(jī)制的生物學(xué)信息。本實(shí)驗(yàn)旨在全基因組范圍內(nèi)篩選肝細(xì)胞癌的相關(guān)致病基因,初步研究目的基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的增殖、凋亡的影響,開發(fā)肝癌潛在的治療靶點(diǎn)。
　　第一章利用基因芯片技術(shù)篩選肝癌組織中的差異表達(dá)基因
　　研究目的:
　　通過Affmetrix基因表達(dá)譜芯片技術(shù)研究肝癌組織與癌旁正常肝組織之間的基因差異表達(dá)譜,篩選出進(jìn)一步研究的致病基因。
　　方法:
　　收集2013年5月至2013年

4、12月期間在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科進(jìn)行肝癌手術(shù)并經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)的原發(fā)性肝癌病人的組織標(biāo)本,建立了肝癌標(biāo)本庫,并按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行標(biāo)本的采集、處理、保存等。本研究經(jīng)過南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并通過受試對(duì)象的知情同意。
　　在肝癌標(biāo)本庫中隨機(jī)選取了手術(shù)切除的肝癌組織及癌旁正常肝組織共10對(duì)采用Affmetrix基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行分析:提取總RNA,質(zhì)量檢定基本合格后,對(duì)RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記,芯片雜交,清洗,用GeneCh

5、ip Scanner3000掃描儀掃描芯片,得到雜交芯片的圖像資料,用GeneChip Operating software(GCOS)圖像分析軟件對(duì)掃描得到的原始圖像進(jìn)行分析處理,得到芯片上兩種樣本各點(diǎn)的雜交信號(hào)強(qiáng)度值以及其信號(hào)強(qiáng)度比值。比值大于或等于2時(shí),我們認(rèn)為兩樣本之間是有顯著差異的。
　　結(jié)果:
　　總RNA質(zhì)檢結(jié)果:10組樣品總RNA的質(zhì)量可靠,可入選用于下一步的芯片雜交實(shí)驗(yàn)。經(jīng)cDNA微陣列基因芯片初步篩選,結(jié)

6、果由SAM軟件分析處理,得到肝癌組織和癌旁正常組織的差異表達(dá)基因:相對(duì)癌旁正常肝組織,在肝癌組織中共有93個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào);68個(gè)基因表達(dá)明顯下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1、肝癌與正常肝組織之間存在明顯差異表達(dá)的mRNA,這些差異表達(dá)的基因可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,可能成為新的肝癌分子標(biāo)記物或潛在的治療靶點(diǎn)。
　　2、EIF3B過表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。
　　第二章EIF3B抑制肝癌SMMC-7721細(xì)

7、胞株增殖的研究
　　研究目的:
　　通過一系列的體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn),研究 EIF3B對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的作用,以便進(jìn)一步了解EIF3B在肝癌中的生物學(xué)功能。
　　方法:
　　找吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建EIF3B的干擾 RNA,利用慢病毒包裝轉(zhuǎn)染至肝癌SMMC-7721細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)分為兩組:1、陰性對(duì)照組(Negative Control),為正常目的細(xì)胞、加陰性對(duì)照病毒感染的細(xì)胞組;2、EIF3B-siRNA組,為正常目的細(xì)胞

8、、加 EIF3B-siRNA慢病毒感染的細(xì)胞組。應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察 EIF3B下調(diào)對(duì)肝癌 SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響,通過流式細(xì)胞術(shù)分析EIF3B下調(diào)對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果:
　　1、細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示:EIF3B-siRNA組與對(duì)照組比,活細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.05),增殖能力受到抑制;
　　2、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:EIF3B-siRNA組與對(duì)照組相比,細(xì)胞克