Ebp1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響.pdf

1、肝癌的發(fā)生是許多基因表達(dá)水平的改變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)一系列分子變化的結(jié)果。因而從基因水平研究肝癌的癌基因、抑癌基因的變化，尋找差異表達(dá)的基因，不僅可以在病理上尋找原因，同時(shí)可以為早期診斷和治療以及預(yù)后提供依據(jù)。
　　ErbB-3是表皮生長(zhǎng)因子家族中的重要成員，而Ebpl（Ebp1）是新發(fā)現(xiàn)的一種 ErbB-3胞內(nèi)結(jié)合蛋白。在外界刺激作用下 Ebpl與 ErbB-3分離到達(dá)核內(nèi)，可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞分化。研究表明Ebpl抑

2、制細(xì)胞增殖的能力與其調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因有關(guān)。研究顯示，Ebpl基因具有p48和p42兩個(gè)部分，兩者表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖起不同的效應(yīng)。p48位于細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)，過(guò)度表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增值；而p42位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，過(guò)度表達(dá)時(shí)將抑制細(xì)胞增值。盡管文獻(xiàn)報(bào)道，Ebp1與乳腺癌、前列腺癌及口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖有關(guān)，但是其在肝癌中的作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。由于綠色熒光蛋白（GFP）可在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)發(fā)出綠色熒光，可起到示蹤作用，因此，利用Northern blo

3、t方法觀察Ebp1基因mRNA在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，之后建立pEGFP-C1質(zhì)粒為載體的pEGFP-C1-Ebp1真核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞，觀察Ebp1過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。
　　首先提取培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中提取總RNA進(jìn)行Northern blot觀察Ebp1基因mRNA的表達(dá)，之后利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)擴(kuò)增Ebp1基因，并建立Ebp1基因與綠色熒光蛋白（GFP）基因融合表達(dá)載體pEGFP-Ebp1；使用

4、脂質(zhì)體法，將重組的Ebp1基因轉(zhuǎn)入293細(xì)胞，并利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后第二天開始利用新霉素G418篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)目的基因Ebp1的細(xì)胞系及分析克隆集落的形成，對(duì)陽(yáng)性表達(dá)克隆細(xì)胞通過(guò)Western blot鑒定Ebp1蛋白的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：Northern blot結(jié)果顯示，與NIH3T3和HEK293細(xì)胞相比Hep3B、Hep G2和Huh-7肝癌細(xì)胞系中Ebp1基因mRNA過(guò)表達(dá)；構(gòu)建了Eb

5、p1與EGFP融合表達(dá)載體pEGFPC1-Ebp1，且熒光顯微鏡下可見(jiàn)被轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞發(fā)出綠色熒光；Western blot鑒定結(jié)果穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系過(guò)表達(dá)Ebp1蛋白；克隆集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果，轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞克隆數(shù)多于轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞。
　　以上的結(jié)果提示：
　　1.構(gòu)建了Ebp1與GFP基因融合表達(dá)載體pEGFPC1-Ebp1，而且建立了穩(wěn)定表達(dá)該真核表達(dá)載體的HEK293細(xì)胞系；
　　2.肝癌細(xì)胞中Ebp1基因