MiRNA在肝癌干細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中差異表達(dá)譜的研究.pdf

1、 研究背景與目的：
腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)認(rèn)為腫瘤中存在一群數(shù)量極少,具有自我更新和分化能力的腫瘤細(xì)胞,即腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cell,CSC)。目前研究發(fā)現(xiàn),腫瘤干細(xì)胞是維持腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源,消滅腫瘤干細(xì)胞可能成為治愈腫瘤、防止復(fù)發(fā)的新方向。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)一些mircoRNA(miRNA)的異常表達(dá)導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,并廣泛參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)旨在探討通過(guò)非粘附

2、球培養(yǎng)法從肝癌細(xì)胞系中富集肝癌干細(xì)胞,利用基因芯片技術(shù)篩查腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜,分析兩者表達(dá)譜的差異,為進(jìn)一步探討miRNA在肝癌干細(xì)胞分化中的作用和調(diào)控機(jī)制提供新的線索。
方法：
1、應(yīng)用非粘附球培養(yǎng)法從肝癌細(xì)胞系中富集到肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞球,并進(jìn)行體外擴(kuò)增。利用腫瘤干細(xì)胞的一些特性對(duì)富集到的肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞球進(jìn)行鑒定。
2、將通過(guò)鑒定的肝癌干細(xì)胞提取總 RNA。利用紫外分光光度計(jì)和

3、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì)提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。對(duì)符芯片要求的RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記再與Exiqon miRNA基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行雜交。然后用掃描得到的芯片結(jié)果進(jìn)行miRNA表達(dá)差異分析。
結(jié)果：
1、利用非粘附球培養(yǎng)法可以在Hep3B、 HepG2、 Huh7細(xì)胞系中富集得到懸浮成球生長(zhǎng)的細(xì)胞球且都能持續(xù)傳代。且單細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)證實(shí)懸浮細(xì)胞球是由單個(gè)細(xì)胞增殖形成,不是多個(gè)細(xì)胞聚集。
2、富集得到的Huh7懸

4、浮細(xì)胞球細(xì)胞體外形成的集落數(shù)是Huh7細(xì)胞二倍。說(shuō)明細(xì)胞球細(xì)胞體外集落形成能力較Huh7細(xì)胞強(qiáng)。
3、Huh7 細(xì)胞被甲苯胺藍(lán)染成藍(lán)紫色,而 Huh7 懸浮細(xì)胞球細(xì)胞不能被染色,說(shuō)明干細(xì)胞培養(yǎng)條件下的腫瘤細(xì)胞球的細(xì)胞通透性降低。
4、流式檢測(cè)Huh7懸浮細(xì)胞球細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志分子CD326為93%,腫瘤細(xì)胞的CD326為0.2%,表明在Huh7懸浮細(xì)胞球細(xì)胞的干細(xì)胞特異性分子表達(dá)明顯上調(diào)。
5、裸鼠成

5、瘤實(shí)驗(yàn)顯示5000個(gè)Huh7懸浮細(xì)胞球細(xì)胞細(xì)胞就能使裸鼠成瘤,而huh7最少需要10萬(wàn)個(gè)才能成瘤。說(shuō)明Huh7懸浮細(xì)胞球細(xì)胞的成瘤性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于普通腫瘤細(xì)胞。
6、分別取Huh7細(xì)胞和第3代的Huh7懸浮細(xì)胞球細(xì)胞用Trizol法提取總RNA,并用紫外分光光度計(jì)測(cè)得OD280/260值分別為2.04；2.07 。瓊脂糖電泳得到的28s、18srRNA條帶明亮清晰,亮度比值約為2：1,miRNA完整性好符合芯片檢測(cè)要求。

6、 7、利用 Hy3TM對(duì)樣本 RNA 進(jìn)行標(biāo)記后跟 miRNA 芯片進(jìn)行雜交,用Genepix 4000B 對(duì)圖像進(jìn)行掃描分析,把圖像信號(hào)用Genepix Pro6.0 軟件轉(zhuǎn)化成數(shù)字信息并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。從結(jié)果中可以看出miRNA在肝癌細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞中的表達(dá)有顯著差異。
8、miRNA芯片分析：共獲得 383個(gè)差異表達(dá)的miRNAs,其中110個(gè)表達(dá)上調(diào),273 個(gè)表達(dá)下調(diào),部分表達(dá)差異明顯的 miRNAs 可能與調(diào)控肝