肝干細胞和肝癌細胞β-catenin蛋白表達及誘導分化的實驗研究.pdf

1、目的： 1.摸索較為經(jīng)濟實用的肝干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定分析方法。通過建立大鼠肝卵圓細胞的增殖模型，采用膠原酶消化法分離卵圓細胞，再經(jīng)過Percoll密度梯度離心純化，分離出肝卵圓細胞。進行培養(yǎng)和肝干細胞標志物鑒定，期望得到下步試驗所需要的肝干細胞，進一步研究肝干細胞定向誘導向肝細胞和膽管細胞分化的細胞形態(tài)學變化規(guī)律。 2.通過對wnt信號途徑的關(guān)鍵分子β-catenin在肝干細胞和肝癌細胞的表達及細胞內(nèi)分布的比較，研究w

2、nt信號在肝干細胞和肝癌細胞分布的差異及其對細胞增殖、分化作用的關(guān)系。證實wnt信號途徑對肝卵圓細胞增殖及分化的調(diào)控作用。 3.通過肝干細胞和肝癌細胞在誘導分化前后細胞形態(tài)、生長曲線、細胞分泌白蛋白和AFP功能變化，及β-catenin分布的差異比較，研究β-catenin在肝干細胞和肝癌細胞增殖和分化中發(fā)揮的作用。 方法： 用AAF/PH建立了大鼠肝卵圓細胞增殖模型，用膠原酶消化法自大鼠AAF/PH模型中分離單

3、個肝卵圓細胞，經(jīng)過Percoll梯度離心純化肝卵圓細胞懸液，細胞懸液接種于0.2％明膠處理的含10％胎牛血清和含SCF20ng/ml，HGF10ng/ml，EGF10ng/ml，LIF10ng/ml的DMEM/F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶進行增殖培養(yǎng)。新分離的肝卵圓細胞用免疫熒光和WesternBlotting檢測c-kit干細胞抗原，RT-PCR法檢測其CK19和白蛋白抗原，對肝卵圓細胞進行鑒定。采用免疫細胞化學，免疫組織化學和Western

4、:Blotting技術(shù)檢測β-catenin在肝干細胞和肝癌細胞的表達及其細胞膜、細胞漿和細胞核分布，比較肝干細胞和肝癌細胞表達和細胞內(nèi)分布的差異性。用含生長因子SCF20ng/ml，HGF10ng/ml，EGF10ng/ml，地塞米松1.0×10-7mol/L，1.5％DMSO，HSS20ng/ml的誘導培養(yǎng)液對進行肝干細胞及肝癌細胞株的誘導分化，觀察誘導分化前后兩種細胞形態(tài)變化和β-catenin表達和細胞表達及分布的變化。

5、 結(jié)果： 1.成功制造了大鼠AAF/PH肝卵圓細胞增殖模型，部分肝切除手術(shù)后11-12d取肝，經(jīng)過膠原酶Ⅳ消化肝組織和Percoll梯度離心肝細胞懸液等相對簡單的方法提純肝卵圓細胞，所得細胞存活率90％，細胞數(shù)1.0×105～1.0×106/ml。新分離的肝卵圓細胞大小基本均勻，為卵圓形，其直徑相當于成熟肝細胞1/4～1/6。免疫熒光技術(shù)和免疫印跡分析顯示新分離的肝卵圓細胞有c-kit抗原表達，而成熟的肝細胞和膽管細胞就無明顯的

6、c-kit蛋白表達。RT-PCR分析顯示，成熟的肝細胞僅表達白蛋白mRNA，膽管上皮細胞僅表達CK19的mRNA，而新分離的肝卵圓細胞表達CK19和白蛋白基因mRNA，提示肝干細胞具有干細胞標志和成熟的肝細胞及膽管上皮細胞的標志，具有兩種分化的潛能。我們采用的AAF喂養(yǎng)大鼠方法、肝組織取材和消化、梯度離心和肝卵圓細胞培養(yǎng)方法與前人都有有明顯的改進。 2.免疫細胞化學染色顯示W(wǎng)B大鼠肝干細胞、L2肝細胞、SMCC-7721和Hep

7、G2人肝癌細胞胞膜和胞漿均有β-catenin表達，而傳統(tǒng)的免疫組化對細胞核內(nèi)表達不易分辨清楚。我們首次采用WesternBlotting檢測四種細胞株和新分離的肝卵圓胞漿和胞核β-catenin，發(fā)現(xiàn)五種細胞胞漿均有明顯β-catenin表達，HepG2和SMCC-7721肝癌細胞株灰色條帶較深，而肝細胞和肝干細胞灰色條細而淺，肝卵圓細胞漿只有少量β-catenin表達。HepG2和SMCC-7721細胞胞核β-catenin表達明顯

8、，核內(nèi)條帶灰度甚至比細胞漿高，而WB和L2肝細胞僅有少量表達，肝卵圓細胞核內(nèi)未檢測到β-catenin積聚，提示肝癌細胞漿和細胞核有β-catenin較高表達。 20例肝癌組織β-catenin免疫組化染色顯示細胞膜、細胞漿均有不同程度表達，與正常組織和肝硬化的組織相比，有三個顯著特點： ①肝癌細胞膜β-catenin表達量明顯減少，胞膜分布不連續(xù)，甚至缺如，細胞間界限不清楚； ②細胞漿內(nèi)明顯的β-catenin

9、過表達，且細胞漿分布不均勻。 ③隨肝癌分化程度不同，β-catenin表達也有明顯差異，高分化肝癌細胞膜β-catenin分布較為清楚連續(xù)，細胞間有界限，細胞漿表達量較多，分布均勻。中度分化的肝癌細胞膜和細胞漿內(nèi)β-catenin分布界與高低分化之間。低分化肝癌，β-catenin在細胞膜表達較少，細胞界限不清楚，細胞漿β-catenin分布不均勻，呈點狀積聚。 WesternBlotting檢測肝癌細胞核β-caten

10、in表達情況，結(jié)果顯示，正常組織細胞漿有β-catenin表達，而細胞核未見明顯的β-catenin表達，灰色條帶不明顯，而且6例肝癌組織(其中1例為低分化肝癌)細胞漿和細胞核β-catenin表達均較為明顯，核內(nèi)β-catenin條帶灰度甚至比細胞漿高，結(jié)果提示肝癌細胞漿β-catenin過表達和胞核β-catenin積聚。 3.從HepG2、SMCC-7721和WB細胞株誘導前后細胞生長曲線的變化看，相同時間內(nèi)誘導劑使細胞增

11、殖提高1倍，而且在前五天生長較快。WB肝干細胞株在誘導后第3d、5d、7d產(chǎn)生白蛋白較HepG2細胞高(P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05)，第5d產(chǎn)生白蛋白較SMCC-7721細胞高(P＜0.05)，然而，這三種細胞在誘導期細胞株產(chǎn)生AFP的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。誘導后HepG2、SMCC-7721和WB細胞形態(tài)呈現(xiàn)不同程度的變化，細胞變?yōu)槎嘈涡曰蜷L梭狀，但始終未見象肝卵圓細胞那樣分化產(chǎn)生成熟的肝細胞。免疫細胞化學顯

12、示誘導前后三種細胞株β-catenin的表達及胞膜、胞漿分布無明顯變化。新分離的肝卵圓細胞誘導分化第3d出現(xiàn)成熟的肝細胞，第5d出現(xiàn)類似膽管樣的長梭形細胞。隨著時間延長，肝干細胞數(shù)目逐漸減少，成熟的肝細胞增多，后期樹突樣膽管細胞為主。新分離的肝卵圓細胞加氯化鋰后，第3d肝卵圓細胞增殖加快，分化為成熟肝細胞數(shù)目較未加氯化鋰者少。WesternBlotting檢測三種細胞株胞漿和胞核β-catenin表達條帶灰度與誘導前相近，肝卵圓細胞漿有

13、少量表達，胞核未見明顯β-catenin表達條帶。提示誘導分化劑對于三種細胞株，不象肝卵圓細胞那樣分化明顯，只是細胞形態(tài)和增殖速度的變化。兩種檢測結(jié)果提示對于增殖較快的細胞株和肝癌細胞，β-catenin在胞漿和胞核有較高的表達和分布，而較易分化的肝卵圓細胞胞漿表達β-catenin量少，胞核無明顯β-catenin積聚。 結(jié)論： 1.本研究成功制造了大鼠AAF/PH肝干細胞增殖模型，建立了利用簡單實用分離肝干細胞的方法

14、。不僅注意到肝干細胞直徑只有成熟肝細胞的1/4～1/6，其具有干細胞的標志，具有成熟肝細胞和膽管細胞的標志，即有向兩個方向分化的潛能，而且經(jīng)過誘導培養(yǎng)更清楚的觀察到肝卵圓細胞分化成肝細胞和膽管細胞的細胞體積和形態(tài)的變化過程。 2.本實驗使用westernblotting方法檢測細胞漿和胞核β-catenin表達，比免疫組化更精確和直觀，結(jié)合免疫組化對細胞膜和胞漿β-catenin表達，更準確檢測細胞膜、細胞漿和細胞核分布。肝干細

15、胞和肝癌細胞在β-catenin表達和細胞內(nèi)分布具有明顯差異，肝干細胞胞膜分布均勻連續(xù)，胞漿有少量表達，胞核內(nèi)沒有積聚。而癌細胞胞膜β-catenin分布不均勻、不連續(xù)甚至缺如，細胞分化越差胞膜β-catenin分布越少，肝癌細胞漿存在β-catenin過度表達，胞核內(nèi)β-catenin積聚非常明顯。這種細胞β-catenin分布的差異決定其生物學行為的不同，肝癌胞膜β-catenin分布越少可能與癌細胞易肝內(nèi)血行轉(zhuǎn)移有關(guān)，胞核內(nèi)β-c

16、atenin積聚使癌細胞增殖快，分化不良等癌高度惡性可能有聯(lián)系。研究結(jié)果提示β-catenin在肝干細胞和肝癌細胞表達和細胞內(nèi)分布與其增殖速度和分化程度有很大關(guān)系。 3.肝卵圓細胞經(jīng)誘導產(chǎn)生成熟肝細胞和膽管上皮樣細胞，分化過程中干細胞具有體積由小到大，細胞形態(tài)也有較大改變的過程。對此過程的認識，有利于肝癌可能起源于肝干細胞理解，這與過去認為肝癌起源于體積大而成熟的肝細胞有很大差異。肝卵圓細胞存在β-catenin表達，氯化鋰可使

17、肝卵圓細胞增值加快，分化卻受到抑制，證實了肝干細胞同樣存在β-catenin信號途徑，而且也可能調(diào)控肝干細胞的增殖和分化。 4.從某些方面看，肝干細胞和肝癌細胞β-catenin蛋白表達有差異，也有共性。肝干細胞株具有永生性生長的能力，誘導分化培養(yǎng)液中多種細胞生長因子通過其相應(yīng)受體激活胞漿β-catenin信號，促進細胞的增殖。肝干細胞株增殖速度較快，具有癌細胞的胞漿和胞核β-catenin積聚的特征，所不同的是細胞膜分布均勻連