胎肝干細胞誘導分化為胰島素分泌細胞的研究.pdf

1、本文研究了胎肝干細胞的特性，并誘導其分化為胰島素分泌細胞，著重進行了胎肝干細胞的體外擴增培養(yǎng)，探討胎肝干細胞的生物學特性和性質(zhì)，以及胚胎發(fā)育中胎肝前體細胞的類型；采用階段性化學誘導、生物誘導以及二者相結(jié)合的方法，啟動胰腺發(fā)育的相關(guān)基因，使胎肝干細胞分化為胰島素分泌細胞。 全文共分四個部分。 第一部分，胎肝干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。 通過體外分離培養(yǎng)并擴增大鼠胎肝干細胞，研究其形態(tài)、生物學特性，采用免疫細胞化學分析

2、胎肝干細胞表面標志物的表達情況，初步研究胎肝干細胞體外擴增培養(yǎng)的實驗條件，并探討肝臟的發(fā)生發(fā)育及肝干細胞的性質(zhì)及增殖潛能。 本實驗選取胎齡12～16dSD大鼠，先用機械分離結(jié)合酶消化法分離培養(yǎng)胎肝細胞，繼而用特異的干細胞培養(yǎng)基進行克隆篩選法獲得了數(shù)量較多、較純化的胎肝干細胞克隆。SABC法檢測原代、傳代后及細胞克隆中的肝干細胞特異表面標志物OV-6、CK-19及胰腺前體細胞特異標志蛋白Nestin的表達。 以上研究表明，

3、胎肝干細胞可通過克隆篩選法進行體外擴增，含有特殊細胞因子的干細胞培養(yǎng)基有助于肝干細胞的擴增，可獲得較好的效果。培養(yǎng)3d左右開始出現(xiàn)小細胞團，1個月即形成肉眼可見的細胞集落，5～7d傳代一次。原代、傳代培養(yǎng)的胎肝細胞部分表達OV-6、CK-19及Nestin；細胞克隆幾乎全部為干細胞標志陽性細胞，表明胎肝干細胞具有較強的分裂增殖能力。胎肝內(nèi)存在Nestin陽性干細胞，我們稱之為肝源性Nestin陽性祖細胞(nestin-positiveh

4、epatic-derivedprogenitor，NHPcells)，可能是一種更為原始的干細胞在胚胎發(fā)育中起重要作用。 第二部分，胎肝組織細胞的鑒定及分類。 本部分實驗旨在研究胎肝干細胞性質(zhì)的同時也為肝干細胞進行較系統(tǒng)的分類提供實驗依據(jù)，探討肝臟中干/祖細胞的類型并篩選出易于向胰腺方向分化的細胞類型，為下一步的誘導獲取較佳的種子細胞。 采用免疫熒光雙標記法，針對OV-6、CK-19及Nestin三種抗體中二種抗

5、體的不同組合，F(xiàn)ITC和Cy3分別標記，DAPI染核，針對胎肝組織和原代、傳代及克隆培養(yǎng)的細胞中不同的前體細胞類型進行初步的定位及分類。 胎肝中包含了從原始到成熟不同發(fā)育程度的各種肝臟細胞：(1)多能前體細胞：OV-6+nestin+CK-19-細胞，可能具有肝胰多向分化潛能；(2)雙能前體細胞：OV-6+CK-19+nestin-細胞，是肝臟的雙能干細胞，可分化為肝細胞系和膽管細胞系；(3)定向前體細胞或過渡細胞：僅表達OV-

6、6或僅表達CK-19，可能分別是僅有向肝臟方向分化能力的肝前體細胞和向膽管方向分化的細胞，或是正在分化為成熟細胞的過渡階段；(4)較成熟細胞。體外獲得的nestin+細胞數(shù)量較少，大多是與OV-6一同表達，僅表達nestin的細胞數(shù)量很少。OV-6+nestin+細胞和nestin+細胞可能具有向胰腺細胞分化的潛能，從胰島發(fā)育的過程推測β細胞與肝細胞有共同的來源，它們共同的祖細胞是胰腺導管上皮內(nèi)和肝內(nèi)的nestin陽性細胞。因此我們選取

7、此類肝源性nestin陽性祖細胞作為下一步誘導分化的種子細胞。 第三部分，EGFP-PDX-1融合表達載體電穿孔轉(zhuǎn)染大鼠胎肝干細胞的研究。 本室構(gòu)建了PDX-1綠色熒光蛋白融合表達載體，通過電穿孔轉(zhuǎn)染入大鼠胎肝干細胞以得到較穩(wěn)定的表達，期望借助于外源性生物因子啟動胎肝干細胞中PDX-1基因的表達，從生物誘導方面研究胰腺內(nèi)分泌發(fā)育的關(guān)鍵基因PDX-1在肝干細胞定向分化中的調(diào)控機制，為今后定向分化的深入研究提供物質(zhì)平臺。

8、 由PDX-1插入pEGFP-Cl的多克隆位點中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-C1-PDX-1用電穿孔法轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠胎肝干細胞，分析轉(zhuǎn)染前后細胞的生長曲線，熒光顯微鏡下觀察GFP發(fā)光情況，RT-PCR鑒定PDX-1基因的表達情況。 經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染后GFP和PDX-1的融合蛋白能在胎肝干細胞中一起表達，并維持較長的時間，對胎肝干細胞的生長增殖無顯著影響(P＞0.05)。構(gòu)建的PDX-1綠色熒光蛋白融合表達載體能在胎肝干細胞中較

9、持續(xù)地表達，為研究PDX-1在干細胞定向分化為胰島素分泌細胞中的調(diào)控作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 第四部分，胎肝干細胞誘導分化為胰島素分泌細胞的研究。 采用階段特異性的化學誘導、生物誘導以及二者相結(jié)合的方法，模擬胰腺發(fā)育的內(nèi)外環(huán)境，使胎肝干細胞分化為胰島素分泌細胞，并探討肝干細胞誘導分化為胰島素分泌細胞的內(nèi)源性及外源性調(diào)控機制。 將篩選出的nestin陽性胎肝細胞分組誘導，分別進行分階段的以Nicotinamide為誘導

10、劑的化學誘導、電穿孔轉(zhuǎn)染PDX-1基因的生物誘導、生物誘導后化學誘導以及未誘導組。ELISA檢測細胞上清液中胰島素的含量，繪制標準曲線后換算出各組細胞釋放的胰島素量并比較；RT-PCR檢測與胰腺發(fā)育相關(guān)的基因和肝細胞特異基因在各組的表達情況。 Nestin+胎肝細胞經(jīng)生物、化學及二者結(jié)合法誘導后分泌的胰島素量分別為0.539、0.943和5.58ng/ml上清液(1×105細胞)，與陰性對照組相比均有顯著性差異(P=0.000)

11、，其中任意兩組相比也有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。各誘導組均表達胰島素Ⅰ、GLUT-2及肝干細胞標志HNF-1、AFP和c-met，而不表達胰高血糖素、生長抑素和ALB。生物誘導組和生化誘導組表達PDX-1和胰島素Ⅱ，化學誘導組弱表達這兩個基因。生化誘導法通過模擬細胞內(nèi)外的微環(huán)境能獲得較高的胰島素分泌水平，并表達一系列胰腺發(fā)育相關(guān)的基因，但是，nestin+胎肝細胞誘導分化為胰島素分泌細胞的機制還需更深入的研究，以實現(xiàn)胰島素的生理性分