NAMPT對非酒精性脂肪肝的調控作用.pdf

1、目的:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精和其他明確的損傷肝因素外所致的肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征。其包括單純性脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化、肝硬化甚至發(fā)展為肝癌。據(jù)統(tǒng)計，普通成人NAFLD發(fā)病率為10％～30％，其中10％～20％為NASH，后者10年內肝硬化發(fā)生率

2、高達25％。目前，NAFLD已被認為是替代病毒性肝炎成為未來數(shù)十年引起慢性肝病和肝臟移植的主要因素。NAFLD的發(fā)病機制最新的理論“多重打擊學說”被廣泛接受，主要指環(huán)境、個體基因以及腸道微生物等多種因素共同作用引起肝臟的脂肪變、炎癥、氧化應激、固有免疫活化等導致肝細胞的死亡、肝臟的損傷。
　　煙酰胺磷酸核糖轉移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT），是哺乳動物細胞中一個重要的

3、輔酶NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，又稱輔酶Ⅰ）的合成限速酶。近年的研究表明，NAD參與了一系列重要生命活動，包括:炎癥、胰島素抵抗、肥胖和血脂調節(jié)。因為已知炎癥、胰島素抵抗、肥胖和血脂異常在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，而NAMPT又是這些因素的重要調節(jié)因子。所以本課題的研究目的利用課題組前期構建的酶失活突變體NAMPT轉基因小鼠（Dominant-Negative NAMPT transgenic，簡稱DN-NAMPT小鼠）探

4、討在肝臟組織NAMPT酶活性下調時對NAFLD的調控作用，為NAFLD的治療提供一些可靠的實驗證據(jù)和依據(jù)。
　　內容：本研究首先通過免疫印記（Western Blotting）檢測了NAMPT在肝臟中的表達情況，然后檢測了在高脂飼料（High-Fat Diet，HFD）喂食12周誘導的NAFLD模型小鼠的肝臟組織和血清NAMPT的表達情況。
　　然后分別探討了DN-NAMPT小鼠在標準飲食和高脂飼料（High-Fat Die

5、t，HFD）喂食(NAFLD模型)的病理變化，檢測了血清谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)，用HE、油紅O、TUNEL染色觀察了肝臟組織的病理學變化，通過肝臟組織勻漿測定了肝臟甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)的含量以及SOD、MDA氧化應激的指標，利用實時定量熒光PCR(Real-time PCR)檢測了甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)轉運相關基因mRNA的表達，免疫組織化學(Immunohistochemistry)檢測了

6、組織巨噬細胞的侵潤和TNF-α、IL-6等炎癥分子的表達。
　　在研究得到肯定的結果后，又通過免疫印記(Western Blotting)、實時定量熒光PCR(Real-time PCR)、Masson染色和免疫組織化學測定了DN-NAMPT小鼠NAFLD模型肝組織的纖維化程度，并用Western Blotting初步探討了NAMPT與NLRP3炎癥小體之間的關系。
　　結果：
　　1.免疫印記結果表明NAMPT在肝臟

7、組織的相對表達量很高，且在高脂飼料(HFD)誘導的NAFLD模型中，NAMPT在肝臟中有表達下調的趨勢。與之對應NAFLD小鼠肝臟NAD水平也有明顯的下調。
　　2.在DN-NAMPT轉基因小鼠上，DN-NAMPT可能通過競爭性結合底物干擾內源性NAMPT的表達和活性，導致DN-NAMPT小鼠肝臟組織的NAMPT與NAD的表達水平均下調。
　　3.在給予標準飼料喂食時，可以看到與WT小鼠相比DN-NAMPT小鼠的肝指數(shù)增大，

8、AST和ALT也有一定的升高，這提示我們DN-NAMPT小鼠出現(xiàn)了一定的肝損傷。同時，DN-NAMPT小鼠血脂有輕微下降趨勢，而肝臟的脂質蓄積明顯增加，油紅O染色也發(fā)現(xiàn)肝細胞內有脂滴出現(xiàn)。在用Real-time PCR檢測了甘油三酯和總膽固醇轉運相關基因mRNA后發(fā)現(xiàn)，肝內與甘油三酯和總膽固醇外排的相關基因MTTP、ABCG1、ABCG5、ABCG8和LDL-R表達下調。ITT與GTT實驗顯示，DN-MNAMPT小鼠出現(xiàn)了輕微的胰島素抵

9、抗。通過F4/80、TNF-α的免疫組織化學表明DN-NAMPT小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的巨噬細胞浸潤和炎癥反應，而IL-6的免疫組織化學卻無差異。兩組小鼠均未出現(xiàn)肝纖維化。
　　4.在HFD誘導的NAFLD模型中，DN-NAMPT和WT小鼠的HE與油紅O染色顯示肝細胞內均有大量脂滴出現(xiàn)，兩種小鼠血脂沒有明顯差異，而DN-NAMPT小鼠肝臟的脂質蓄積依舊明顯增加。DN-NAMPT小鼠肝臟的MDA水平增大，而SOD出現(xiàn)下調。TNF-α的免疫

10、組織化學發(fā)現(xiàn)兩種小鼠肝臟均出現(xiàn)了巨噬細胞浸潤和炎癥反應。但是，DN-NAMPT小鼠的肝組織的炎癥水平（包括通過TNF-α的免疫組化染色，NLRP3、ASC、caspase-1、IL-18和IL-1β的免疫印記）及凋亡(TUNEL staining)更為嚴重。通過Masson染色、α-SMA的免疫印記以及TGF-β、TIMP-1、Pro-Col1α1的Real-time PCR等檢測，我們發(fā)現(xiàn)DN-NAMPT小鼠肝臟的纖維化病變也比WT小