G-四鏈體的穩(wěn)定性、構(gòu)型競(jìng)爭(zhēng)及在端粒酶活性檢測(cè)中的研究.pdf

1、G-四鏈體是由富含鳥嘌呤堿基G的DNA或RNA序列形成的一種特殊的核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)，有望形成G-四鏈體的基因序列廣泛存在于人類基因組的許多重要區(qū)域。近年來(lái)，圍繞G-四鏈體，人們開展了大量的研究工作，包括 G-四鏈體DNA酶的研究、G-四鏈體的構(gòu)型研究及G-四鏈體特異性配體的研究等。圍繞G-四鏈體，本文開展了如下三方面的工作：基于G-四鏈體-hemin DNA酶的端粒酶活性檢測(cè)；分子擁擠條件下pH對(duì)單個(gè)DNA鏈中G-四鏈體與二倍體結(jié)構(gòu)競(jìng)爭(zhēng)的影

2、響研究；用于G-四鏈體熔點(diǎn)檢測(cè)的染料篩選實(shí)驗(yàn)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴端粒酶是一種核糖核蛋白酶，能延伸人類染色體端粒重復(fù)序列（5′-GGGTTA-3′）。由于其與癌細(xì)胞的無(wú)限增殖密切相關(guān)，所以成為抗癌藥物設(shè)計(jì)的新靶點(diǎn)。直到目前端粒酶活性檢測(cè)方法的研究仍然是一個(gè)熱點(diǎn)。設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單高效、不需要聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR-free）的端粒酶活性檢測(cè)方法。這種方法基于端粒酶誘導(dǎo)G-四鏈體-氯化血紅素（hemin）DNA酶的形成。實(shí)驗(yàn)中使

3、用了一種短的、無(wú)標(biāo)記的端粒酶引物。由于這個(gè)引物只包含3個(gè)連續(xù)GGG重復(fù)序列，所以不能形成穩(wěn)定的G-四鏈體。在活性端粒酶和G堿基（dGTP）的存在下，一個(gè)連續(xù)GGG重復(fù)序列可以被加到引物鏈的3′-端。被延伸的引物可以折疊成G-四鏈體，G-四鏈體可以與hemin結(jié)合成具有高效催化活性的G-四鏈體-hemin DNA酶，這種酶可以催化過(guò)氧化氫（H2O2）氧化2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）生成綠色的 ABTS

4、·+。由于引物延伸反應(yīng)生成的產(chǎn)物很短，端粒酶表現(xiàn)出高的周轉(zhuǎn)率，因此提高了方法的靈敏度。用這種方法能夠檢測(cè)到來(lái)自200個(gè)HeLa細(xì)胞的端粒酶活性。⑵人類基因組中存在著大量有望形成G-四鏈體的富G基因序列。但除染色體末端的單鏈端粒區(qū)域外，絕大多數(shù)富 G序列都是與其互補(bǔ)序列共同存在的。這就意味著這些區(qū)域內(nèi)可能存在有 G-四鏈體與二倍體結(jié)構(gòu)的競(jìng)爭(zhēng)作用?？紤]到基因組中二倍體結(jié)構(gòu)的形成過(guò)程更接近于一個(gè)分子內(nèi)的過(guò)程，且細(xì)胞內(nèi)處于一個(gè)非常擁擠的環(huán)境，我

5、們將富G序列及與其互補(bǔ)的富C序列連接成一條DNA鏈，以40％（v/v）的聚乙二醇200（PEG200）來(lái)模擬細(xì)胞內(nèi)的擁擠環(huán)境，用熒光光譜、圓二色（CD）光譜及聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）的方法，對(duì)稀釋和分子擁擠條件下，pH值對(duì)G-四鏈體與二倍體的競(jìng)爭(zhēng)作用進(jìn)行了比較研究。研究結(jié)果表明，在稀釋條件下，富G序列主要被包埋在二倍體結(jié)構(gòu)當(dāng)中，且pH值的變化（5.8~8.0）不會(huì)對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)造成影響。而在分子擁擠條件下，酸性環(huán)境有利于二倍體結(jié)構(gòu)

6、的形成；pH值的增大促使二倍體結(jié)構(gòu)向G-四鏈體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化過(guò)程主要發(fā)生在pH值6.7~7.4之間。這一研究結(jié)果可以為探討某些基因序列的生理功能、闡明一些疾病的發(fā)病機(jī)理及以這些富G序列為靶進(jìn)行相關(guān)藥物的研制提供必要的信息。⑶G-四鏈體的熔點(diǎn)（Tm）可以用來(lái)衡量G-四鏈體的熱穩(wěn)定性。很多關(guān)于G-四鏈體的研究中都會(huì)涉及到G-四鏈體熔點(diǎn)的測(cè)定。發(fā)展一種適合高通量測(cè)定的、免標(biāo)記的G-四鏈體熔點(diǎn)測(cè)定方法對(duì)于大批量研究G-四鏈體具有重要的意義。某些

7、染料的熒光對(duì)G-四鏈體結(jié)構(gòu)有高度的依賴性。它們自身沒(méi)有熒光或者熒光很弱，但是與G-四鏈體結(jié)合后熒光會(huì)增強(qiáng)。因此，我們希望找到可以用于檢測(cè)G-四鏈體熔點(diǎn)的熒光染料。實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)熒光染料進(jìn)行篩選，篩選出了SYBR Green I這種熒光染料。并將其應(yīng)用于G-四鏈體的熔點(diǎn)測(cè)定。通過(guò)將測(cè)定結(jié)果與紫外光譜、CD光譜、分子信標(biāo)熒光探針測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在高濃度鉀離子中能得到滿意的結(jié)果；在各個(gè)濃度的鈉離子中，測(cè)得的結(jié)果與紫外和CD的結(jié)果相差一個(gè)定