基于G-四鏈體DNA酶的傳感器設(shè)計(jì)及分子擁擠條件下G-四鏈體的穩(wěn)定性及識(shí)別研究.pdf

1、G-四鏈體DNA酶是G-四鏈體結(jié)合氯化血紅素(Hemin)后形成的一種具有過(guò)氧化物酶活性的人工酶。與天然酶相比，G-四鏈體DNA酶由于具有價(jià)廉、易得、便于存儲(chǔ)、修飾及設(shè)計(jì)靈活等優(yōu)勢(shì)，使其近年來(lái)在傳感器的設(shè)計(jì)方面得到了廣泛的應(yīng)用。
　　就鳥(niǎo)嘌呤堿基G重復(fù)序列之間連接環(huán)長(zhǎng)度對(duì)G-四鏈體形成的影響進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)在連接環(huán)長(zhǎng)度較長(zhǎng)，寡核苷酸鏈不易形成G-四鏈體的情況下，可以通過(guò)將環(huán)序列設(shè)計(jì)成雙鏈結(jié)構(gòu)的方法促進(jìn)G-四鏈體結(jié)構(gòu)的重新形成。這就

2、為傳感器的設(shè)計(jì)提供了一個(gè)新的途徑:利用靶標(biāo)對(duì)雙鏈結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用來(lái)控制G-四鏈體DNA酶的活性。為證明這一點(diǎn)，在雙鏈結(jié)構(gòu)區(qū)域引入T-T堿基錯(cuò)配，破壞雙鏈結(jié)構(gòu)使寡核苷酸鏈?zhǔn)バ纬蒅-四鏈體的能力。Hg2+對(duì)T-T錯(cuò)配的穩(wěn)定作用可以促進(jìn)雙鏈結(jié)構(gòu)的形成，寡核苷酸鏈重新折疊成G-四鏈體。得到的G-四鏈體與氯化血紅素(Hemin)結(jié)合后形成具有過(guò)氧化物酶活性的G-四鏈體DNA酶，從而實(shí)現(xiàn)了Hg2+傳感器的設(shè)計(jì)。利用該Hg2+傳感器，可在10～700

3、 nM濃度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)Hg2+的定量檢測(cè)，檢出限為8.7nM。在此基礎(chǔ)上，利用半胱氨酸可以把Hg2+從T-Hg2+-T堿基對(duì)上競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)的能力，又設(shè)計(jì)了一種半胱氨酸的定量檢測(cè)方法。該方法可以在20～600 nM的濃度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)半胱氨酸的定量檢測(cè)，檢出限為14nM。該傳感器設(shè)計(jì)策略可以很容易地?cái)U(kuò)展到其它一些金屬離子及適配體靶標(biāo)的檢測(cè)當(dāng)中。
　　生物體內(nèi)的細(xì)胞環(huán)境不是簡(jiǎn)單的水溶液，胞內(nèi)環(huán)境不僅包含著可溶的小分子物質(zhì)，例如:各種代謝產(chǎn)物和金

4、屬離子，還包含著許多不可溶的大分子物質(zhì)，例如:多糖，蛋白質(zhì)，脂類(lèi)物質(zhì)和核酸等。這些大分子在細(xì)胞內(nèi)的總濃度約為400 mg.mL-1，約占細(xì)胞體積的30～40％。分子擁擠(molecular crowding conditions)條件引起的“分子擁擠效應(yīng)”不僅影響G-四鏈體的構(gòu)型及穩(wěn)定性，還對(duì)G-四鏈體與小分子的作用有著顯著的影響。因此，在體外實(shí)驗(yàn)中加入分子擁擠試劑用以模擬體內(nèi)的分子擁擠環(huán)境是非常有必要的。正是由于意識(shí)到了這一點(diǎn)，人們有

5、關(guān)G-四鏈體的研究正逐漸由稀溶液條件向分子擁擠條件過(guò)渡。
　　本論文選擇聚乙二醇PEG200作為分子擁擠試劑在體外模擬分子擁擠環(huán)境，利用圓二色光譜儀測(cè)定DNA鏈的構(gòu)型以及紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA鏈的熔點(diǎn)(Tm)，考察了稀釋條件下和分子擁擠條件下鼓環(huán)的大小、數(shù)目對(duì)G-四鏈體構(gòu)型和穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明:隨著鼓環(huán)的增大，DNA鏈形成的G-四鏈體構(gòu)型不發(fā)生改變，但熔點(diǎn)逐漸降低，表明G-四鏈體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性逐漸降低;鼓環(huán)數(shù)目對(duì)G-四鏈體的構(gòu)

6、型和穩(wěn)定性均有顯著影響，數(shù)目越多，穩(wěn)定性越低，G-四鏈體結(jié)構(gòu)越不易形成，因此G-四鏈體結(jié)構(gòu)中允許存在的鼓環(huán)數(shù)目應(yīng)該是有一個(gè)限度的。通過(guò)對(duì)稀釋條件和分子擁擠條件下的對(duì)比，本文還得出分子擁擠條件能顯著提高G-四鏈體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。上述結(jié)論拓展了我們對(duì)能形成G-四鏈體的DNA序列的認(rèn)識(shí):非G3+NG3+NG3+NG3+N結(jié)構(gòu)的序列仍有望形成穩(wěn)定的G-四鏈體，為近生理?xiàng)l件下研究人體基因組中的G-四鏈體結(jié)構(gòu)提供了可能性。
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