胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(Ⅱ段)中動物易感陽性對照品優(yōu)化匹配性及其作用機制的研究.pdf

1、1.目的：
　　 比較敵枯雙和環(huán)磷酰胺兩種陽性對照藥物致畸敏感性,為大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(Ⅱ段生殖毒性)中設(shè)置適當?shù)膬?yōu)化匹配的陽性對照品作依據(jù),并對其發(fā)生的可能機制進行研究。
　　 2.方法：
　　 挑選成年健康雌雄SD大鼠以1:1的比例在當日下午17:00時后合籠交配,于次日晨檢查陰栓和涂片,查到陰栓或涂片查到精子者的確定為交配成功,交配成功日為孕D0。雌性SD大鼠60只,分為6組,其中設(shè)陰性對照兩組,分

2、別給予0.5％的羧甲基纖維素鈉(CMC)灌胃和生理鹽水尾靜脈注射;敵枯雙兩組于孕D10,分別灌胃給予敵枯雙11.0mg/kg和13.8mg/kg;環(huán)磷酰胺兩組于孕D10,分別尾靜脈給予環(huán)磷酰胺7.2mg/kg和9.0mg/kg;從孕D0開始稱重,以后每3d稱體重1次。在孕D20用3％戊巴比妥納注射液麻醉處死孕鼠,解剖,取出胎仔,檢查黃體數(shù)、子宮連胎仔重、胎盤重量、活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)、活胎重量、頂臀長及外觀和骨骼畸形,制備孕鼠血清用

3、于血SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)、NO(一氧化氮)的測定。每組1/3的胎仔經(jīng)茜素紅染色后進行骨骼畸形檢查,2/3的胎仔去除內(nèi)臟后放入4％甲醛溶液固定兩周后做脊髓病理切片觀察脊髓病理組織學(xué)改變;采用免疫組化SABC法檢測敵枯雙組胎仔脊髓PCNA(增殖細胞核抗原)蛋白表達和環(huán)磷酰胺組胎仔脊髓凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白的表達,以及神經(jīng)細胞凋亡狀態(tài)。神經(jīng)細胞凋亡用凋亡指數(shù)(AI)表示,AI=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100％。

4、基因Bcl-2、Bax蛋白的表達強度用平均灰度值G表示,蛋白表達越強G值越小。
　　 3.結(jié)果：
　　 敵枯雙低劑量組和高劑量組胎仔發(fā)生的骨骼畸形率分別是92.59％和100％,分別與環(huán)磷酰胺低劑量和高劑量組胎仔骨骼畸形率78.5％和100％相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0,05),敵枯雙低劑量組和高劑量組胎仔發(fā)生的外觀畸形率分別是84.62％和86.84％,外觀畸形率比環(huán)磷酰胺低劑量和高劑量組2.6％和0.0％增高(P＜0.0

5、1),而且敵枯雙組胎仔畸形種類較多,如:四肢短小、心臟外露、臍疝、腹裂、顯性脊柱裂、尾畸形(無尾、卷尾、短尾)、肛門閉鎖等,骨骼畸形有顱骨發(fā)育不全、肋骨畸形(分叉肋、融合肋、缺肋)、脊柱骨缺失(尾椎缺失、腰椎缺失)、胸骨發(fā)育遲緩等;環(huán)磷酰胺組外觀畸形發(fā)生的較少,唇裂;骨骼畸形較明顯,以顱骨發(fā)育不全、胸骨發(fā)育遲緩為主。
　　 從光鏡下觀察,敵枯雙低劑量組胎仔的胸髓和腰髓病理切片中分別發(fā)現(xiàn)有82.35％(14/17)和75％(12/

6、16)出現(xiàn)中央管消失或偏移,基板、翼板分界不清、神經(jīng)細胞明顯減少,脊髓嚴重萎縮等病理改變(P＜0.01)?？蓦p高劑量組的胸髓和腰髓病理切片中分別發(fā)現(xiàn)有66.67％(4/6)和100％(7/7)出現(xiàn)上述病理改變(P＜0.01)。環(huán)磷酰胺兩個劑量組胎仔的脊髓病理切片均未發(fā)現(xiàn)畸形病變。
　　 脊髓凋亡的神經(jīng)細胞核體縮小散在于脊髓中,凋亡神經(jīng)細胞核內(nèi)清晰可見深藍色顆粒,凋亡細胞與周圍細胞分離,陰性對照CMC組胎仔胸髓和腰髓前角凋亡指數(shù)為

7、0.8％和0.6％,與敵枯雙低劑量組胎仔的胸髓和腰髓前角凋亡指數(shù)0.7％和0.5％和敵枯雙高劑量組胎仔的胸髓和腰髓前角凋亡指數(shù)0.5％和0.9％相比,均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。環(huán)磷酰胺低劑量組胎仔的胸髓和腰髓細胞凋亡指數(shù)分別為3.1％和3.9％,與生理鹽水組胎仔的胸髓和腰髓細胞凋亡指數(shù)0.5％和0.7％相比明顯增加(P＜0.01)。
　　 通過計算陽性細胞百分率,結(jié)果顯示PCNA主要在脊髓細胞核上表達呈黃褐色,并在灰質(zhì)和白

8、質(zhì)中均有表達,CMC組胎仔胸髓和腰髓細胞與敵枯雙低劑量組和高劑量組胎仔胸髓和腰髓細胞的PCNA表達無明顯差別(P＞0.05)。
　　 Bcl-2和Bax主要在胎仔脊髓的前角細胞的胞漿中表達,生理鹽水組胎仔胸髓和腰髓前角細胞的Bcl-2和Bax表達灰度值G值分別是Bcl-2(120.46±10.08和124.84±11.23),Bax(141.76±10.13和139.86±13.89);環(huán)磷酰胺低劑量組胎仔胸髓和腰髓前角細胞的B

9、ax表達明顯增強(P＜0.01),灰度值G值分別為106.68±8.76和107.30±11.27。環(huán)磷酰胺低劑量組胎仔胸髓前角細胞的Bcl-2表達明顯減弱(P＜0.01),灰度值G值為141.93±13.73;環(huán)磷酰胺低劑量組胎仔腰髓前角細胞的Bcl-2表達較弱(P＜0.05),灰度值G值為134.82±9.67。
　　 環(huán)磷酰胺低劑量組孕鼠血清中MDA含量與生理鹽水組MDA無差別(P＞0.05),環(huán)磷酰胺高劑量組孕鼠血清中M

10、DA含量均顯著高于生理鹽水組和環(huán)磷酰胺低劑量(P＜0.01)。環(huán)磷酰胺低劑量組和高劑量組孕鼠血清NO濃度顯著高于生理鹽水組(P＜0.05),環(huán)磷酰胺低劑量組孕鼠血清中的SOD活性明顯高于生理鹽水組(P＜0.01),而環(huán)磷酰胺高劑量組孕鼠血清中的SOD活性明顯低于生理鹽水組(P＜0.01)。
　　 4.結(jié)論：
　　 (1)與環(huán)磷酰胺比較,敵枯雙為SD大鼠較為敏感的致畸陽性藥物,在孕D10給予11mg/kg敵枯雙一次性灌胃為

11、最理想的陽性對照設(shè)計方案。
　　 (2)敵枯雙和環(huán)磷酰胺均有母體毒性及胚胎毒性,敵枯雙和環(huán)磷酰胺用藥途徑、劑量差異較大,在用藥時間相同情況下導(dǎo)致不同類型畸形,提示兩種藥物在體內(nèi)代謝途徑不同,可能通過不同途徑導(dǎo)致畸形的發(fā)生。
　　 (3)同等條件下,敵枯雙誘導(dǎo)胎仔產(chǎn)生的多個靶組織(尾、肋骨和胸骨)的缺失或畸形和脊髓畸形,推測兩者可能有內(nèi)在聯(lián)系。在本研究條件下,我們發(fā)現(xiàn)敵枯雙導(dǎo)致神經(jīng)管未閉和脊髓畸形與細胞凋亡機制沒有明顯關(guān)系

12、。
　　 (4)環(huán)磷酰胺的神經(jīng)管致畸劑量在7.2mg/kg至9.0mg/kg之間,若能選擇一個合適的劑量很有可能誘導(dǎo)出脊髓畸形的模型。在環(huán)磷酰胺作用下脊髓神經(jīng)細胞過度凋亡,提示神經(jīng)細胞的過度凋亡與脊椎裂畸形的發(fā)生密切相關(guān)。
　　 (5)環(huán)磷酰胺組脊髓神經(jīng)細胞Bax蛋白表達強,Bcl-2蛋白表達弱,有促進細胞凋亡的作用;而正常胎仔脊髓神經(jīng)細胞Bcl-2蛋白表達強,Bax蛋白表達弱,抑制神經(jīng)細胞過度凋亡;可見,在脊椎裂畸形發(fā)