擬南芥轉(zhuǎn)錄因子bHLH34和bHLH104調(diào)控鐵平衡.pdf

1、UniversityofScienceandTechnologyofChinaADissertationforDoctor’SDegreebHLH34andbHLH104transcriptionfactorsregulateironhomeostasisinArabidopsisthalianaAuthor’SName：Speciality：一●Supervisor：Finishedtime“l(fā)nlShedXiaoliLibioche

2、mistryandmolecularbiologyProfDiqiuYuJan，2016摘要摘要鐵作為許多功能蛋白的重要輔助因子，對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著極其重要的作用。在人類中，缺鐵是弓l起人類貧血癥的主要原因之一，而植物性食物是人類獲得鐵的主要來(lái)源，因此研究植物體內(nèi)鐵的吸收，轉(zhuǎn)運(yùn)以及調(diào)控的機(jī)制是非常重要的。bHLH38／39／100／101是四個(gè)調(diào)控?cái)M南芥缺鐵響應(yīng)的重要基因，但它們是如何被缺鐵信號(hào)激活的還不清楚。為此，我們以bHLHl

3、01的啟動(dòng)子為誘餌進(jìn)行酵母單雜交實(shí)驗(yàn)。通過(guò)篩選，我們鑒定到一個(gè)bHLH蛋白，bHLH34，它可以直接結(jié)合到bHLHl01的啟動(dòng)子上。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，bHLH34的同源蛋白bHLHl04也可以結(jié)合到bilLHl01的啟動(dòng)子上。這暗示bHLH34和bHLHl04可能也參與植物的缺鐵響應(yīng)調(diào)控。為了證實(shí)我們的推測(cè)，我們從擬南芥種質(zhì)資源中心獲得了bHLH34和bHLHl04兩個(gè)基因的TDNA插入突變體，通過(guò)RTPCR鑒定，兩個(gè)突變體都是缺失突變體

4、。考慮到bHLH34和bHLHl04可能存在功能冗余性，我們又通過(guò)雜交構(gòu)建了bhlh34bhlhl04雙突變體。表型分析發(fā)現(xiàn)，在缺鐵條件下，bhlh34，bhlhl04單突變體和bhlh34bhlhl04雙突變體都表現(xiàn)出了典型的缺鐵癥狀，即葉子的黃化和根的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，其中bhlh34bhlhl04雙突變體的缺鐵癥狀最為嚴(yán)重。為了進(jìn)一步驗(yàn)證bHLH34和bHLHl04的功能，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)人工microRNA，amiRbhlh34／10

5、4，它可以同時(shí)特異性的靶向bHLH34和bHLHl04兩個(gè)基因。我們構(gòu)建了amiRbhlh34／104轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在缺鐵條件下也表現(xiàn)出了典型的缺鐵癥狀，其表型與bhlh34bhlhl04雙突變體類似，這說(shuō)明amiRbhlh34／104轉(zhuǎn)基因植株模擬了bhlh34bhlhl04雙突變體的表型。鐵還原酶活性的升高是植物缺鐵的一個(gè)典型指標(biāo)，因此我們檢測(cè)了野生型和突變體的鐵還原酶活性。在缺鐵條件下，野生型植株和突變體的鐵還原酶活性

6、都顯著升高，但是突變體的鐵還原酶活性遠(yuǎn)低于野生型，而且bhlh34bhlhl04雙突變體的鐵還原酶活性最低。鐵含量檢測(cè)表明，無(wú)論在鐵充足還是鐵缺少的情況下，bhlh34bhlhl04雙突變體根和葉的鐵含量都顯著低于野生型。為了揭示bHLH34和bHLHl04的分子調(diào)控機(jī)制，我們分析了缺鐵響應(yīng)基因的表達(dá)情況。鐵吸收直接相關(guān)的兩個(gè)基因腰刀和FR02以及正調(diào)控植物缺鐵響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子MYBIO，MYB72，bHLH38／39／100／101和冊(cè)