軍曹魚(yú)生長(zhǎng)激素基因(GH)的克隆和表達(dá).pdf

1、生長(zhǎng)激素(Growth Hormone)是GH/PRL/SL家族的一個(gè)成員,其功能是對(duì)魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖等起著非常重要的調(diào)控作用。DNA重組技術(shù)為GH基因重組提供了可能性,實(shí)現(xiàn)了外源生長(zhǎng)激素在魚(yú)體中的促生長(zhǎng)作用。本論文以軍曹魚(yú)為研究對(duì)象,對(duì)該魚(yú)的生長(zhǎng)激素(GH)基因進(jìn)行克隆和原核表達(dá),并對(duì)GH基因在軍曹魚(yú)各組織中的表達(dá)分布進(jìn)行了分析。
　　 根據(jù)鱸形目GH基因氨基酸序列的同源性設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并性引物來(lái)擴(kuò)增軍曹魚(yú)腦垂體cDNA,獲

2、得了軍曹魚(yú)GH基因cDNA片段后用同源克隆的方法獲得了軍曹魚(yú)GH基因3’和5’非編碼區(qū)域,進(jìn)而得到軍曹魚(yú)GH基因全長(zhǎng)cDNA序列。最后通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增軍曹魚(yú)腦垂體基因組DNA,獲得了內(nèi)含子的序列。該基因序列全長(zhǎng)1780bp,其中5’端非編碼區(qū)為(5’-UTR)77 bp,3’端非編碼區(qū)(3’-UTR)為170 bp,整個(gè)開(kāi)放閱讀框(OFR)長(zhǎng)1533 bp,包括5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子,cDNA序列全長(zhǎng)615 bp,編碼204個(gè)氨基

3、酸,其中含22個(gè)信號(hào)肽和182個(gè)成熟肽,預(yù)測(cè)分子量約為23.17 kDa,理論等電點(diǎn)為6.43。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),軍曹魚(yú)GH基因與哺乳動(dòng)物和四腳動(dòng)物的同源性低于40％,與鱸形目魚(yú)類(lèi)的同源性高于80％,其中與鲯鰍的同源性最高,同源性達(dá)到97.5％。
　　 生長(zhǎng)激素是生長(zhǎng)軸(GH—IGF-1)的重要組成部分,它控制魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)和發(fā)育。生長(zhǎng)激素通過(guò)結(jié)合肝細(xì)胞膜受體后在許多組織中起作用,本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,分析了GH基因在

4、成體軍曹魚(yú)10個(gè)組織的表達(dá)差異,結(jié)果表明,GH基因在軍曹魚(yú)腦垂體中表達(dá)量最高,其次是性腺,而在肝臟,腦,心臟,腎臟,脾臟,胃,肌肉和鰓中有極少的表達(dá)量。
　　 采用T-A克隆構(gòu)建pMD18-T-CoGH重組質(zhì)粒,測(cè)序正確后經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切獲得CoGH片段,插入表達(dá)載體pET-28a,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)SDS-PAGE顯示為分子量23kDa的蛋白條帶,經(jīng)過(guò)western blo

5、tting檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)目的蛋白與His抗體特異性結(jié)合,證明目的基因在大腸桿菌中成功表達(dá)。
　　 本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了GH基因在大腸桿菌中的表達(dá)條件,從宿主菌、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑的濃度等方面進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)顯示軍曹魚(yú)GH基因在宿主菌BL21中不表達(dá),而在BL21(DE3)中則大量表達(dá)。該基因在溫度為37℃,誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為1 mmol/L時(shí)誘導(dǎo)4 h,蛋白的表達(dá)量最大,但可溶性較差。通過(guò)超聲波破碎實(shí)驗(yàn)證明該基因隨著溫度的降低蛋