達(dá)氏鰉(Husodauricus)生長(zhǎng)激素基因克隆及原核表達(dá)分析.pdf

1、達(dá)氏鰉（Huso dauricus）起源于距今一億三千萬年的白堊紀(jì)，自然種群集中存在于我國黑龍江流域的中下游，是世界上僅存的兩種鰉魚之一。達(dá)氏鰉是淡水水域中個(gè)體最大的魚類，其魚肉營養(yǎng)豐富、鮮香味美，其中它含有的不飽和脂肪酸和造血維生素葉酸是其他魚類的3～5倍；其卵制成的魚子醬更是極其美味，售價(jià)較高，被譽(yù)為“黑黃金”，因此達(dá)氏鰉具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　生長(zhǎng)激素（Growth hormone，GH）是由動(dòng)物腦垂體合成、儲(chǔ)存、分泌的一

2、種單一的肽類激素，能夠促進(jìn)其生長(zhǎng)、發(fā)育。魚類生長(zhǎng)激素不但具有一般生長(zhǎng)激素所具有的作用，還能加快合成蛋白質(zhì)、加速降解脂類等功能，此外還擁有調(diào)控滲透壓特別是海與河間洄游性魚類的滲透壓、提高餌料吸收效率等作用，因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用價(jià)值。近年來，由于過度的捕撈，使達(dá)氏鰉的野生數(shù)量銳減，個(gè)體也趨于小體化且因其生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，所以應(yīng)用生物學(xué)手段，加快開展其生長(zhǎng)激素等相關(guān)基因的研究至關(guān)重要。
　　本研究采用反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse

3、Transcription，RT-PCR）和快速cDNA末端擴(kuò)增法（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）首次克隆出達(dá)氏鰉生長(zhǎng)激素全長(zhǎng)cDNA，應(yīng)用其全長(zhǎng)序列對(duì)達(dá)氏鰉的分子系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了比對(duì)研究，旨在為從分子水平研究達(dá)氏鰉生長(zhǎng)激素作用特點(diǎn)、進(jìn)化機(jī)制以及在形態(tài)分類基礎(chǔ)上研究達(dá)氏鰉的分類地位提供理論依據(jù)，并為以后能夠更深入研究該基因做鋪墊。同時(shí)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Quantitative Rea

4、l-time PCR）技術(shù)，對(duì)達(dá)氏鰉10種常見組織中的GH mRNA表達(dá)量進(jìn)行了定量分析，從而進(jìn)一步了解魚類GH是否能以旁分泌或自分泌的方式對(duì)其生長(zhǎng)、發(fā)育及繁殖起到重要的作用。最后，將生長(zhǎng)激素基因進(jìn)行原核表達(dá)，并對(duì)蛋白表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，為達(dá)氏鰉GH基因的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　第一，采用RT-PCR方法得到達(dá)氏鰉生長(zhǎng)激素中間片段、采用RACE方法得到3’、5’端片段，并將它們拼接在一起，得到達(dá)氏鰉生長(zhǎng)激素全長(zhǎng)cD

5、NA，總長(zhǎng)為1004bp，其中5’非編碼區(qū)為47bp、3’非編碼區(qū)（含PolyA尾30bp）為312bp，開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）為645bp。經(jīng)過BLAST分析ORF的堿基組成，AT占51.32％，GC占48.68%，共編碼214個(gè)氨基酸，分子量為24.25kDa，理論等電點(diǎn)為6.82。翻譯起始密碼ATG，終止密碼TAG?；蚣巴茖?dǎo)的蛋白序列已登入GenBank，序列號(hào)為：KP055783。
　

6、　達(dá)氏鰉與其他鱘形目魚類的GH成熟肽進(jìn)行對(duì)比，其氨基酸序列幾乎相同，其一致性高達(dá)98.89%。同源性分析，結(jié)果顯示達(dá)氏鰉與歐洲鰉同源性最高為98.5%，歧化性為1.3%；使用NJ法建立分子進(jìn)化樹，結(jié)果顯示達(dá)氏鰉相對(duì)于哺乳類動(dòng)物，如家鼠和人，它們之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與同是硬磷總目的雀鱔目中的長(zhǎng)吻雀鱔和大雀鱔的親緣關(guān)系較近，而與歐洲鰉、達(dá)氏鱘、中華鱘的親緣關(guān)系最近。
　　第二，采用Quantitative Real-time PCR方

7、法檢測(cè)了GH基因在達(dá)氏鰉肌肉、性腺、胃、腦垂體等10種不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，GH基因不同組織中存在差異性，GH mRNA的表達(dá)量在腦垂體中最高；肌肉、腦次之；而在腸、性腺、胃、心臟、鰓、肝臟、脾臟中只有少量表達(dá)。
　　第三，將達(dá)氏鰉GH基因連接到表達(dá)載體Blunt E1中，構(gòu)建成Blunt E1-OFR重組質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）菌株后，優(yōu)化其表達(dá)條件，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IPTG為0.6mmol/L，在3