β3-AR-OPA1在糖脂代謝性心臟損傷中的作用研究.pdf

1、背景:
　　隨著全球患者數(shù)量快速的增多和患病率迅速的增長(zhǎng)，糖尿病已經(jīng)成為本世紀(jì)全球所面臨的最嚴(yán)重、最危急的公共健康問(wèn)題之一。2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)是最常見(jiàn)的也是最主要的糖尿病類型，而其中67.1％患者伴有血脂異常。
　　目前，小鼠糖尿病模型的建立最常采用的是化學(xué)法，其中通過(guò)腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)應(yīng)用十分廣泛。有研究顯示通過(guò)小劑量多次腹腔注射STZ

2、能夠成功構(gòu)建T2DM模型。反之，構(gòu)建1型糖尿病模型則通常采用大劑量STZ注射。而在本實(shí)驗(yàn)中，我們嘗試?yán)酶咧嬍陈?lián)合大劑量STZ方式構(gòu)建T2DM伴高脂血癥小鼠模型并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　G蛋白偶聯(lián)受體被發(fā)現(xiàn)與糖尿病以及心血管疾病有著密切的聯(lián)系。β3腎上腺素能受體(β3-AR)作為膜受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族。目前β3-AR在心肌中的作用存在分歧。一部分研究發(fā)現(xiàn)β3-AR在心衰大鼠心臟的心房及心室中的表達(dá)均明顯上調(diào)，認(rèn)為其對(duì)壓力超

3、負(fù)荷的肥大心肌以及心衰心肌能起到保護(hù)作用。而另一部分研究發(fā)現(xiàn)β3-AR持續(xù)增長(zhǎng)，產(chǎn)生過(guò)度的負(fù)性肌力作用，從而導(dǎo)致心功能的進(jìn)行性惡化。其中值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)心肌細(xì)胞使用β3-AR激動(dòng)劑，能夠明顯增加心肌細(xì)胞凋亡，因此我們推測(cè)β3-AR可能通過(guò)增加細(xì)胞凋亡從而導(dǎo)致心臟功能的損傷。
　　線粒體動(dòng)態(tài)平衡的紊亂與心血管疾病密切相關(guān)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成的增加在其中起著不可忽視的作用。RO

4、S被認(rèn)為與糖尿病心肌損傷有著密切的關(guān)系。當(dāng)ROS的產(chǎn)生超過(guò)了機(jī)體的抗氧化能力后，就會(huì)對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞膜、DNA和蛋白直接損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，線粒體動(dòng)態(tài)平衡的紊亂將導(dǎo)致線粒體功能障礙。而線粒體內(nèi)膜的融合主要由視神經(jīng)萎縮癥蛋白1(optical atrophy-1，OPA1)來(lái)介導(dǎo)。有研究顯示糖尿病小鼠心臟線粒體中OPA1的表達(dá)量明顯降低，并且線粒體出現(xiàn)了顯著的分裂和形態(tài)異常。
　　因此，本研究通過(guò)建立T2DM伴高脂血癥小鼠模型和高

5、糖高脂細(xì)胞模型，探討β-AR/OPA1在高糖高脂對(duì)心肌細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.將SPF級(jí)C57BL/6J遺傳背景健康雄性小鼠分為兩組:對(duì)照組進(jìn)食普通飼料;實(shí)驗(yàn)組進(jìn)食60％脂肪熱能的高脂飼料(D12492)3周后予以腹腔注射STZ（100mg/kg）。兩組小鼠測(cè)量體重、空腹血糖、進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)。檢測(cè)小鼠血清TG水平、TC水平、LDL-c水平、FFA水平，ELISA試劑盒檢測(cè)血清胰島素含量。檢測(cè)血清BNP

6、以及心臟超聲檢查。肝臟組織油紅O染色。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)OPA1的表達(dá)。
　　2.實(shí)驗(yàn)組小鼠再次隨機(jī)分為三組:生理鹽水組（腹腔注射生理鹽水）、激動(dòng)劑組（腹腔注射BRL37344）、抑制劑組（腹腔注射SR52390A）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)心肌組織β3-AR和OPA1表達(dá)情況。Masson染色觀察心肌纖維化情況。電鏡觀察心肌線粒體結(jié)構(gòu)變化。免疫熒光染色觀察OPA1表達(dá)情況。

7、
　　3.小鼠心肌細(xì)胞系(MCM)分為3組:高糖+0μmol/L軟脂酸鈉干預(yù)組、高糖+200μmol/L軟脂酸鈉干預(yù)組、高糖+400μmol/L軟脂酸鈉干預(yù)組，并分別干預(yù)8小時(shí)和16小時(shí)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)OPA1的表達(dá)。siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建OPA1下調(diào)的心肌細(xì)胞模型并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染的有效性。測(cè)定各組細(xì)胞ROS變化

8、情況、凋亡情況、線粒體膜電位和ATP變化情況。觀察NAC干預(yù)后ROS變化和凋亡變化。
　　結(jié)果:
　　1.予以進(jìn)食含60％脂肪熱能的高脂飼料(D12492)后小鼠體重明顯升高，肝臟組織油紅O染色可見(jiàn)明顯的脂肪滴。腹腔注射STZ后空腹血糖、血清胰島素含量明顯升高、糖耐量異常，檢測(cè)血清TG水平、TC水平、LDL-c水平、FFA水平均較普通進(jìn)食小鼠明顯升高。T2DM伴高脂血癥小鼠血清BNP升高，心臟超聲檢查結(jié)果提示舒張功能受損，心

9、肌OPA1在mRNA和蛋白水平上表達(dá)減少。
　　2.β3-AR激動(dòng)劑上調(diào)β3-AR并抑制OPA1的表達(dá)，加重線粒體結(jié)構(gòu)破壞;β3-AR抑制劑在下調(diào)β3-AR的同時(shí)能夠上調(diào)OPA1表達(dá)。免疫熒光染色與實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果與前保持一致。Masson染色發(fā)現(xiàn)，β3-AR激動(dòng)劑加重心肌組織纖維化，抑制劑減輕纖維化。
　　3.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著軟脂酸鈉濃度增加和干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞凋亡水平明顯增加。高脂干預(yù)后小鼠心肌細(xì)胞OP

10、A1在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)減少，但ROS水平卻顯著升高。OPA1 siRNA轉(zhuǎn)染成功后發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞ROS水平升高、凋亡增加、線粒體膜電位降低和ATP減少。予以NAC干預(yù)后ROS水平下降，凋亡減少。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飲食聯(lián)合大劑量STZ建立T2DM伴高脂血癥小鼠模型。高糖高脂狀態(tài)下OPA1能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激減輕心肌凋亡。T2DM伴高脂血癥小鼠心肌組織中β3-AR表達(dá)增加。通過(guò)激動(dòng)β3-AR能夠下調(diào)OPA1