強(qiáng)力霉素調(diào)控的重組人胰島素原基因載體的構(gòu)建及體外表達(dá)研究.pdf

1、目的：基因治療過(guò)程中,所表達(dá)的目的基因產(chǎn)物需要有量的控制,如果持續(xù)表達(dá)則可造成表達(dá)產(chǎn)物過(guò)量,引起毒副作用,對(duì)機(jī)體造成不良影響,對(duì)胰島素基因治療尤其是如此.為此,該研究構(gòu)建了單質(zhì)粒的強(qiáng)力霉素調(diào)控的胰島素基因表達(dá)轉(zhuǎn)移載體系統(tǒng),以便定量調(diào)節(jié)胰素基因在C2C12細(xì)胞中的表達(dá).方法：該研究采用了四環(huán)素基因調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)粒作為基因表達(dá)的載體.四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)分為tet-off和tet-on兩型,該研究采用了tet-on系統(tǒng).通過(guò)基因重組,將四環(huán)素調(diào)控

2、表達(dá)系統(tǒng)的兩個(gè)質(zhì)粒pUHrT2-1和pUHC13-9改造成單一的質(zhì)粒,并將重組的胰島素原基因克隆入此表達(dá)系統(tǒng)成為四環(huán)素調(diào)控的胰島素基因轉(zhuǎn)移載體（prTR-tetO-mINS）.通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將prTR-tetO-mINS和pLNCX（含neo基因）共同轉(zhuǎn)染入成肌細(xì)胞系C2C12,同時(shí)以pLNCX為對(duì)照.轉(zhuǎn)染后3天加入G418,篩選7天,形成陽(yáng)性克隆,將G418濃度減半繼續(xù)培養(yǎng)7天,然后分別以0、2、10μg/ml濃度的強(qiáng)力霉素誘導(dǎo).