攜帶重組人胰島素基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細胞的實驗研究.pdf

1、目的：1.探討人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stemcells hUCMSCs)體外分離、培養(yǎng)、純化條件，并對hUCMSCs的生物學(xué)特性進行研究；2.構(gòu)建含人重組胰島素(insulin)與增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因慢病毒表達載體pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP，并進行慢病毒顆粒的包裝，純化，濃縮及滴度測定；3.以GFP作為報告基因，篩選慢病毒轉(zhuǎn)染人臍帶

2、間充質(zhì)干細胞最適MOI值，為進一步進行攜帶外源基因的轉(zhuǎn)染探索條件；4.研究攜帶重組人胰島素慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細胞后，基因及蛋白水平的表達情況，為進一步進行體內(nèi)回植提供研究基礎(chǔ)。
　　 方法：1.將剔除動脈和靜脈的新鮮人臍帶組織剪成小塊培養(yǎng)(1mm×lmm×lmm)，培養(yǎng)1-2周后得到貼壁細胞，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，細胞計數(shù)繪制細胞生長曲線；應(yīng)用流式細胞儀鑒定細胞表面標(biāo)志；化學(xué)染色檢測體外誘導(dǎo)成脂和成骨分化的能力

3、；2.應(yīng)用PCR方法擴增獲得insulin基因序列，在目的基因上游加上BamHI，下游加上AscI兩個酶切位點；將PCR產(chǎn)物進行T載體克隆，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5α細胞中，通過篩選獲得重組質(zhì)粒pMDl8T-insulin，測序分析選定序列正確的克隆提取質(zhì)粒；用限制性內(nèi)切酶分別酶切pMDl8T-insulin和pLenti6.3-IRES-EGFP質(zhì)粒，將insulin基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP載體連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH

4、5α細胞中，通過篩選獲得慢病毒表達載體pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP，并進行測序。中量抽提慢病毒載體，將慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝病毒，純化及濃縮并測定病毒滴度。3.以EGEP作為報告基因，分別以MOI值0，1，3，5，7，10，15，20轉(zhuǎn)染細胞，觀察48小時，72小時，96小時，熒光表達情況，篩選慢病毒轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細胞最適轉(zhuǎn)染時間及MOI值；4.轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細胞，應(yīng)用qPCR及RT-PC

5、R方法檢測重組人胰島素基因表達情況，應(yīng)用westen bloting方法檢測胰島素蛋白表達情況。
　　 結(jié)果：l.體外培養(yǎng)一周，細胞從組織塊中爬出；細胞傳代培養(yǎng)至第10代，無明顯形態(tài)及增值能力改變；細胞陽性表達CD44，CDl06，而CD34，HLA-DR表達陰性。體外誘導(dǎo)實驗證實，hUCMSCs具有成脂及成骨分化的能力。2.聚合酶鏈反應(yīng)獲得長度347bp帶有BamHI和AscI兩個酶切位點序列的目的基因，經(jīng)與克隆載體pMDl8

6、-T載體和慢病毒表達載體pLenti6.3-IRES-EGFP連接，構(gòu)建慢病毒表達載體pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP。成功包裝病毒，純化及濃縮并測定病毒滴度。3.重組慢病毒載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI)值是10時，轉(zhuǎn)染效率最高可達到90％。應(yīng)用qPCR及RT-PCR方法檢測重組人胰島素基因表達情況，證實基因水平的表達量，轉(zhuǎn)染組為陽性，未轉(zhuǎn)染組為陰性。應(yīng)用westen bloting方法檢測胰島素蛋白