LIF基因慢病毒載體構(gòu)建及其在人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá).pdf

1、目的:
　　1、建立人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Adipose StemCells，hASCs)的分離、培養(yǎng)、鑒定及凍存、復(fù)蘇的方法，獲得大量高純度的hASCs，為后續(xù)的研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　2、構(gòu)建LIF慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得高表達(dá)LIF的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　方法:
　　1、從抽脂手術(shù)患者中得到脂肪組織，Ⅰ型膠原酶消化分離得到hASCs，接種于含10％ FBS的DMEM培養(yǎng)基中培

2、養(yǎng)，并且傳代擴(kuò)增，取第3代生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，在液氮中凍存6個(gè)月后復(fù)蘇，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率，MTT法描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凍存前后細(xì)胞表面分子CD44、CD105、CD29、CD73、CD31、HLA-DR的表達(dá)水平。
　　2、PCR擴(kuò)增得到LIF基因序列，采用質(zhì)粒重組技術(shù)獲得載有LIF基因的重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒包裝慢病毒，將慢病毒轉(zhuǎn)染人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)慢病

3、毒轉(zhuǎn)染率，RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)LIF的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1、在倒置顯微鏡下，hASCs大小均一，呈長(zhǎng)梭形編織狀。復(fù)蘇后，hASCs存活率可達(dá)到(91.25±3.02)％;凍存前后hASCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)無(wú)顯著差異，均為“S”形曲線(xiàn);經(jīng)過(guò)2～3 d的潛伏期后，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入增殖期，約7d左右到達(dá)平臺(tái)期。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，hASCs凍存前后，CD44、CD105雙陽(yáng)性細(xì)胞率分別為(99.85±0.0

4、1)％和(98.06±0.03)％;CD29、CD73雙陽(yáng)性細(xì)胞率分別為(92.60±0.03)％和(91.22±0.04))％，CD31陽(yáng)性細(xì)胞率分別為(4.19±0.01)％和(3.83±0.01)％;HLA-DR陽(yáng)性細(xì)胞率分別為(1.02±0.01)％和(1.51±0.01)％。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果提示，細(xì)胞凍存前后各指標(biāo)組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2、通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增得到LIF基因序列，并且成功構(gòu)建帶有LIF基因的重組

5、質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切鑒定，得到大小為608 bp左右的條帶，大小與LIF基因序列匹配，通過(guò)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后獲得慢病毒顆粒，滴度檢測(cè)達(dá)1×108 TU/ml。慢病毒轉(zhuǎn)染hASC后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染率可達(dá)90％。RT-PCR及Western blot結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染后LIF的表達(dá)水平明顯升高。
　　結(jié)論:
　　1、人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，并且凍存前后，存活率和一般生物學(xué)特性無(wú)明顯變化。<