人GJB6基因突變對HaCaT細胞增殖與凋亡的影響和機制.pdf

1、目的:
　　有汗性外胚葉發(fā)育不良(hidrotic ectodermal dysplasia，HED)是一種常染色體顯性外胚葉發(fā)育不良疾病。當編碼Cx30縫隙連接蛋白的GJB6基因發(fā)生突變時，可引起耳聾和有汗性外胚葉發(fā)育不良。本研究中，以Tet-on慢病毒為載體建立穩(wěn)定表達GJB6基因及其突變體的HaCaT細胞株，進一步了解GJB6基因突變引起HaCaT細胞凋亡的機制，初步探究GJB6基因突變體引起HED不同臨床表型的可能機制。<

2、br>　　方法:
　　利用PCR技術擴增人GJB6基因野生型與突變型(A88V、G11R)基因，重組Tet-on慢病毒質粒，經基因測序及酶切技術對其鑒定，再將重組慢病毒轉染入HaCaT細胞，經puromycin篩選出穩(wěn)定表達編碼縫隙連接蛋白Cx30的GJB6基因的細胞株。細胞株加四環(huán)素(DOX)誘導后，通過RT-PCR檢測GJB6基因的mRNA表達量，同時通過Western blot檢測Cx30的表達，從而對穩(wěn)定表達GJB6基因的

3、HaCaT細胞株進行鑒定。用CCK8法檢測GJB6基因野生型與突變型經DOX誘導表達后對細胞增殖的影響。利用流式細胞分析法檢測加DOX誘導基因表達后對HaCaT細胞凋亡的影響。通過Western blot檢測HED相關臨床表型指標和相關凋亡指標的蛋白水平的變化。
　　結果:
　　經酶切、測序鑒定重組慢病毒質粒構建成功。RT-PCR檢測到穩(wěn)定轉染的HaCaT細胞中GJB6基因的mRNA表達量明顯增加，WT（加四環(huán)素）組GJB6

4、基因表達豐度是WT（不加四環(huán)素）組的113.369倍(P＜0.05);A88V（加四環(huán)素）組GJB6基因表達豐度是A88V（不加四環(huán)素）組的3.249倍(P＜0.05);G11R（加四環(huán)素）組GJB6基因表達豐度是G11R（不加四環(huán)素）組的32.011倍(P＜0.05);Western blot可檢測到經DOX處理的WT組和A88V組、G11R組穩(wěn)定表達Cx30，而未經DOX處理的細胞和NC組細胞未檢測到Cx30目的條帶。NC組:加入四

5、環(huán)素與不加入四環(huán)素在各個時間節(jié)點(4、8、12、24、36、48h)吸光度值無統(tǒng)計學差異;WT組:加入四環(huán)素與不加入四環(huán)素在以下時間節(jié)點(4、8、12、24、36h)吸光度值存在統(tǒng)計學差異;A88V組:加入四環(huán)素與不加入四環(huán)素在各個時間節(jié)點(4、8、12、24、36、48h)吸光度值均存在統(tǒng)計學差異;G11R組:加入四環(huán)素與不加入四環(huán)素在各個時間節(jié)點(4、8、12、24、36、48h)吸光度值均存在統(tǒng)計學差異。流式細胞分析法檢測到相比N

6、C組、WT組，A88V、G11R組明顯降低了細胞的增值率，導致HaCaT細胞的凋亡，經統(tǒng)計分析，P＜0.05。加入四環(huán)素誘導后，GJB6基因突變型A88V、G11R可引起內披蛋白表達量降低，絲聚蛋白、角蛋白K6b、兜甲蛋白表達量無明顯變化。凋亡指標Bcl-2、Bax的表達量無明顯改變;Caspase3、Caspase8、Caspase9、PARP等凋亡相關指標可見其剪切體。
　　結論:
　　成功構建出穩(wěn)定表達GJB6基因野生