FGF6基因高表達對鼠心肌細胞凋亡和增殖的影響.pdf

1、目的：克隆小鼠成纖維細胞生長因子6(FGF6)基因cDNA的讀碼框(CDS)，構建攜帶FGF6基因的重組真核表達載體，并將重組質粒轉染至心肌細胞系H9C2細胞中進行表達，測定其轉染效率后探討FGF6基因對心肌細胞增殖及凋亡的影響。
　　 方法：從小鼠心臟組織中提取總RNA，通過逆轉錄聚合酶鏈反應得到總cDNA，PCR法擴增，產物連接pGEM-T Easy載體測序分析正確后，再以PCR方法擴增，將其連接入真核表達質粒PIRES2-

2、DsRed2。以PCR、雙酶切和測序鑒定正確后，將重組載體PIRES2-DsRed2-FGF6用脂質體包裹轉染大鼠心肌細胞(H9C2)，分組:空白對照(BC)組、轉染空質粒(NC)組、轉染重組FGF6-PIRES2-DsRed2質粒(P-FGF6)組，熒光顯微鏡觀察轉染效率，RT-PCR法檢測轉染后FGF6 mRNA表達水平，westernblot法檢測蛋白表達水平。Cell Counting Kit-8（CCK-8）法檢測轉染后細胞的

3、增殖能力;以血清饑餓法誘導心肌細胞凋亡，同時進行FGF6質粒轉染，流式細胞儀檢測細胞凋亡指數(shù)，Western blot方法檢測活化半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）表達。
　　 結果：FGF6 PCR產物片段與pGEM-T Easy載體連接成為重組克隆載體，測序結果與GenBank公布的FGF6序列完全一致，成功克隆了小鼠FGF6基因CDS讀碼框序列;以T-FGF6為模板重新獲得含酶切位點的PCR產物片段與PIRES2-Ds

4、Red2真核表達載體雙酶切經T4連接酶連接獲得重組真核表達載體PIRES2-DsRed2-FGF6，菌液PCR、雙酶切鑒定、測序鑒定等均證實重組真核表達載體構建成功;且證實重組真核表達載體轉染大鼠心肌細胞后，48h后熒光顯微鏡下可見約75％H9C2細胞表達紅色熒光，檢測H9C2細胞的FGF6 mRNA及蛋白表達水平明顯高于BC組（P＜0.01）及NC組（P＜0.01），轉染FGF6基因能提高心肌細胞的增殖能力（P＜0.05），F(xiàn)GF6基