和營安心方對慢性心衰大鼠心肌細胞凋亡的影響

1、<p>　　和營安心方對慢性心衰大鼠心肌細胞凋亡的影響</p><p>　　作者：李永民，王保和 邢立強，薄愛華， 吳迎爽，周寧</p><p>　　【摘要】 　　目的觀察和營安心方對慢性心衰大鼠心肌細胞凋亡的影響。方法以皮下大量注射異丙腎上腺素（ISO）的方法制備慢性心衰大鼠模型，隨機分為模型對照組，卡托普利組，參麥注射液組，和營安心大、中、小劑量組。另設正常對照組，用TUN

2、EL法檢測心肌細胞凋亡，用免疫組化方法檢測心肌細胞Bax，Bcl2蛋白表達，計算Bcl2/Bax比值。結果模型對照組TUNEL法心肌細胞凋亡嚴重，棕褐色細胞核明顯增多，免疫組化圖像分析Bax表達明顯升高，Bcl2，Bcl2/Bax比值明顯下降。與模型對照組比較，和營安心方組心肌細胞凋亡數(shù)量明顯減少，Bax蛋白表達明顯下降，Bcl2，Bcl2/Bax比值明顯升高。結論和營安心方有減抑慢性心衰大鼠心肌細胞凋亡的作用。 </

3、p><p>　　【關鍵詞】 和營安心方； 心力衰竭； 細胞凋亡； 血流動力學</p><p>　　Abstract：ObjectiveTo study the effects of Heyingansxin Fang on myocardial apoptosis in chronic congestive heart failure rats.MethodsAnimal model of

4、 heart failure was induced by subcutaneously injecting large dose of ISO and the rats were randomly divided into model group， captopril group，Shenmai injection group， high dosage of Heyinganxin Fang， middle dosage of He

5、yinganxin Fang ， small dosage of Heyinganxin Fang and normal group. Apoptosis was detected with TUNEL .The Bax and Bcl-2 proteins of</p><p>　　Key words：Heyinganxin Fang; Congestive heart failure; Apoptos

6、is; Hemodynamics</p><p>　　慢性心衰屬于虛勞“心損”的范疇，《難經》認為“損其心者，調其營衛(wèi)”，我們宗《難經》之旨，確立了“調和營衛(wèi)、化淤利水”的慢性心衰治則，組成和營安心方。本實驗觀察了和營安心方對慢性心衰大鼠心肌細胞凋亡的影響。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p>　　1.1

7、 材料雄性Wistar大鼠70只，體重200～240 g，購自河北省實驗動物中心；和營安心方由西洋參6 g，玉竹15 g，云茯苓15 g，桂枝15 g，丹參20 g等組成，中劑量組水煎濃縮為1∶1煎液（每毫升含生藥1 g）、大劑量組為1∶2煎液（每毫升含生藥2 g）、小劑量組為2∶1煎液（每毫升含生藥0.5 g），藥物購自北京同仁堂藥店；鹽酸異丙腎上腺素注射液，2 ml∶1 mg/支，上海禾豐制藥有限公司；卡托普利，25 mg/片，常州

8、制藥廠有限公司；參麥注射液，10 ml/支，河北神威藥業(yè)有限公司；MK1020原位細胞凋亡檢測試劑盒，武漢博士德生物工程公司；Bax，Bcl-2一抗，二步法TV6001免疫組化檢測試劑盒，北京中杉金橋生物技術公司。</p><p>　　1.2 方法 在參考文獻的基礎上［1，2］，略加改進并經預實驗證實，采取皮下多點注射異丙腎上腺素（ISO）的方法，第1天按20 mg/kg，第2天按10 mg/kg，第3～12天

9、按5 mg/kg的劑量連續(xù)皮下給藥，另取11只大鼠為正常對照組，皮下注射等量蒸餾水。造模結束后隨機取2只正常大鼠、5只造模大鼠測定血流動力學指標，兩組指標差異明顯，確認模型制備成功。造模大鼠隨機分為模型對照組，參麥注射液組，卡托普利組，和營安心大、中、小劑量組，每組9只。以人與大鼠體表面積等效劑量比折算量為和營安心中劑量組，擴大兩倍為大劑量組，縮小兩倍為小劑量組，每次灌胃0.8 ml/100 g，1 次/d；卡托普利組配成0.45%蒸餾

10、水溶液，每次灌服1 ml/100 g；正常對照組及模型對照組灌服蒸餾水1 ml/100g；參麥注射液組每天按5 ml/kg腹腔注射參麥注射液；連續(xù)給藥4周。</p><p>　　1.3 觀測指標 </p><p>　　1.3.1 血流動力學指標測定實驗結束，大鼠腹腔注射20%烏拉坦麻醉（1 ml/100 g），游離右側頸總動脈并插入自制的心室插管（充滿1%肝素），通過左側動脈瓣和房室瓣

11、進入左心室，用多導生理記錄及分析系統(tǒng)描記記錄左室內壓峰值（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室內壓上升、下降最大速率（±dp/dtmax）。</p><p>　　1.3.2 心重指數(shù)開胸提起心臟，按相同位置剪斷肺靜脈、肺動脈、主動脈和上下腔靜脈，取出心臟，分析天平稱取心臟重量，計算心重指數(shù)（心重mg/體重g）。</p><p>　　1.3.3 TUNEL法檢測心肌細胞

12、凋亡［3］縱向剪開左心室，從乳頭肌處橫切0.3 cm×0.5 cm的心肌標本，置于10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，按照試劑盒說明嚴格進行操作，用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡，以細胞核染成棕褐色為陽性結果，每組每個心肌標本各取1張切片，每張切片計數(shù)5個高倍視野（400×），計算各組每高倍視野陽性細胞數(shù)。</p><p>　　1.3.4 心肌Bax，Bcl-2蛋白表達

13、及Bcl-2/Bax比值按照二步法TV6001免疫組化試劑盒的說明進行操作，每組每個心肌標本連續(xù)切片，Bax，Bcl-2染色各取1張切片，棕褐色陽性顆粒主要表達于細胞漿，采用計算機圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，攝取400×圖像輸入分析系統(tǒng)內，測定各組圖像的平均灰度值，每張切片于陽性區(qū)選擇5個無重疊視野，以灰度值大小作為待測蛋白的陽性表達指數(shù)，并計算Bcl-2/Bax比值。</p><p>　　1.4 統(tǒng)

14、計分析實驗數(shù)據(jù)用±s表示，應用SPSS12.0進行統(tǒng)計學處理，用單因素方差分析進行組間比較。</p><p><b>　　2 結果</b></p><p>　　2.1 和營安心方對血流動力學、心重指數(shù)的影響結果見表1。與正常對照組比較，模型對照組LVEDP明顯升高，LVSP，±dp/dtmax明顯降低，心重指數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P&a

15、mp;lt;0.01）；與模型對照組比較，和營安心方大、中劑量組LVEDP明顯降低，LVSP，±dp/dtmax明顯升高，心重指數(shù)降低，治療效果接近卡托普利組，差異有統(tǒng)計學意義（P&lt;0.01或P&lt;0.05），說明和營安心方對慢性心衰血流動力學、心重指數(shù)有良好改善作用。</p><p>　　表1 和營安心方對血流動力學、心重指數(shù)的影響（略） </p><

16、p>　　與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01　</p><p>　　2.2 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡結果正常對照組大鼠心肌未發(fā)現(xiàn)細胞凋亡，模型對照組大鼠心肌細胞凋亡嚴重，凋亡細胞呈孤立、散在分布，數(shù)明顯增多，核內有分布均勻的棕褐色顆粒，體積等于或小于正常胞核，每20×20視野平均3.9個；和營安心大劑量組、卡托普利組每高倍視野

17、平均1.5個、1.8個，棕褐色細胞核數(shù)量較少；和營安心中劑量組、小劑量組、參麥注射液組每高倍視野平均2.3，2.9，2.7個，棕褐色細胞核仍較多見。可見，各治療組心肌細胞凋亡數(shù)明顯低于模型對照組，和營安心大劑量組、卡托普利組改善慢性心衰大鼠心肌細胞凋亡的效果最好。</p><p>　　2.3 和營安心方對Bax，Bcl-2，Bcl-2/Bax的影響結果見表2。與正常對照組比較，模型對照組大鼠Bax蛋白表達明顯升

18、高，Bcl-2/Bax比值明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P&lt;0.01）；和營安心大、中劑量組、卡托普利組與模型對照組比較，Bcl-2蛋白表達、Bcl-2/Bax比值明顯升高，Bax蛋白表達明顯下降（P&lt;0.01或P&lt;0.05）。</p><p>　　表2 和營安心方對Bax，Bcl-2 ，Bcl-2/Bax的影響（略） </p><p>　　與正常

19、對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01?。籲=8　</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　《難經》認為“損其心者，調其營衛(wèi)”，《內經》在闡述“營衛(wèi)致病”時提出了“營氣衰少而衛(wèi)氣內伐”，和“營氣稽留，血澀不行，衛(wèi)氣從之”的病機，我們據(jù)此提出了慢性心衰的中醫(yī)病機假說為“營衛(wèi)不和，營澀衛(wèi)

20、伐，淤結水?！?，并擬定和營安心方，由西洋參、玉竹、桂枝、云茯苓、丹參等組成。西洋參、玉竹益氣生津，充養(yǎng)營氣，益營和陰；桂枝、云茯苓、丹參疏衛(wèi)通陽，活血化淤，寧心利水。全方補氣生津，益營通衛(wèi)，調和營衛(wèi)，活血利水?，F(xiàn)代藥理研究表明，西洋參所含主要成分人參皂苷Rb1，玉竹所含主要成分鈴蘭苷、鈴蘭苦苷有良好的強心作用，而方中所含桂皮醛、丹參素、丹參酮等主要有效成分對慢性心衰也有良好調節(jié)作用［4］。本實驗采取皮下注射ISO的方法復制慢性心衰大鼠模

21、型，ISO連續(xù)12 d皮下注射總量達到80 mg/kg，兒茶酚胺大量入血、持續(xù)刺激造成心肌彌漫性急性壞死［2］，模型對照組大鼠LVSP，±dp/dtmax明顯降低，LVEDP，心重指數(shù)明顯升高，表明左心舒縮功能明顯受損，并出現(xiàn)心室肥大，和營安心方大、中劑量組能明顯升高LVSP，±dp/dtmax，明顯降低LVEDP、心重指數(shù)，對心功能、心室肥大有良好改善作用。</p><p>　　細胞凋亡是遺

22、傳基因控制的細胞自主性死亡過程，是機體清除嚴重受損的細胞、不再需要的細胞和癌變細胞的自身防御性機制，包括Bcl2家族蛋白的調控和胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶的激活等機制。在Bcl2家族蛋白中，Bcl2，Mcl1以及Bclxl均對細胞的生存起著促進作用，即抑制細胞凋亡；而Bax，Bclxs，bak和bad則促進細胞的凋亡，即誘導細胞凋亡。Bcl2 protooncogene是一個抑制凋亡的原癌基因，Bax protoonc

23、ogene是一個誘導細胞凋亡的原癌基因，Bax與Bcl2結合，阻止Bcl2的激活，從而促進凋亡。Bax、Bcl2是調控心肌細胞的關鍵凋亡基因，兩者的比例決定心肌細胞在受到凋亡刺激后是死亡還是存活。慢性心衰時存在廣泛的心肌細胞凋亡，其中Bax基因表達顯著升高，Bcl2基因表達及bcl2 /Bax比值明顯下降，細胞凋亡使心肌細胞數(shù)量減少，導致心肌細胞肥大、纖維化增生，導致心室重構。而神經內分泌激素的持續(xù)異常激活是引起細胞凋亡的重要

24、因素，細胞凋亡是引起心肌死亡乃至心肌重構的重要原因，也是心功能下降的主要原因［5］。而細胞凋亡的特征是核內D</p><p><b>　　【參考文獻】</b></p><p>　?。?］ 沈 雁，曹洪欣，周景華. 溫心膠囊對慢性心功能不全大鼠心功能和心肌基質金屬蛋白酶組織抑制物1表達的研究［J］. 上海中醫(yī)藥雜志，2005，39（5）：55.</p>

25、<p>　?。?］ 李為民，田 穎，孔一慧，等. 異丙基腎上腺素致大鼠心力衰竭模型的實驗研究［J］. 哈爾濱醫(yī)科大學學報，2003，37（5）：386.</p><p>　?。?］ 趙英強，孫蘭軍，李惠臻，等. 強心沖劑對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的影響［J］. 中國臨床康復，2003， 7（12）：1762.</p><p>　?。?］ 沈丕安. 中藥藥理與臨床應用［M］.