白藜蘆醇對高糖誘導(dǎo)的乳鼠心肌細胞損傷和凋亡的保護作用.pdf

1、研究背景
　　隨著生活水平的提高，不良的飲食和生活習(xí)慣盛行，使得糖尿病的發(fā)病率迅速提高，已成為當(dāng)前威脅人類健康的最重要疾病之一。糖尿病的主要損害主要在于其引起的各種器官并發(fā)癥，其中以心血管并發(fā)癥的危害最重，是糖尿病患者死亡的主要原因。與非糖尿病正常心臟相比，糖尿病患者心臟更易受缺血性損傷，且損傷明顯加重，梗塞面積加大、心律失常增加。許多研究證實心肌細胞凋亡可能參與其中?？紤]到心肌細胞是一種終末分化細胞，沒有再生增殖能力，長期慢性的

2、凋亡使其數(shù)量逐漸減少會導(dǎo)致心臟泵功能降低直至心力衰竭。當(dāng)前的許多研究致力于闡明糖尿病引起心肌細胞凋亡的機制，并尋找能抑制糖尿病心肌細胞凋亡的方法和藥物，進而控制糖尿病的發(fā)展和各種并發(fā)癥的發(fā)生。
　　硫氧還蛋白（Thioredoxin，Trx）系統(tǒng)是廣泛表達于機體各種細胞的一個重要的抗自由基系統(tǒng)，在很多涉及自由基損傷和凋亡的疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。我實驗室前期用高糖高脂誘導(dǎo)結(jié)合STZ注射制成2型糖尿病大鼠在體模型和高糖高脂刺

3、激培養(yǎng)的成年大鼠心肌細胞以及H9C2心肌細胞離體模型上都觀察到明顯的心肌細胞凋亡發(fā)生。同時觀察到Trx硝基化、TR活性降低、TXNIP表達上調(diào)，伴隨糖尿病時Trx活性下降。。
　　白藜蘆醇（Resveratrol，RSV）多酚類化合物，是一類主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的多酚類化合物，由于其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、心血管保護，甚至抗衰老作用而受到極大的關(guān)注。近年來研究證實，白藜蘆醇具有一定的對抗糖尿病作用。白藜蘆醇可改善糖

4、尿病誘導(dǎo)的肝臟、胰腺以及腎臟損傷，減少胰島細胞凋亡并改善胰島素抵抗?！?】但目前對白藜蘆醇在糖尿病引起心肌細胞凋亡中的作用及其機制，以及在此過程中白藜蘆醇對Trx系統(tǒng)的影響的還缺乏研究。
　　目的
　　以高糖刺激的乳鼠心肌細胞模擬糖尿病誘導(dǎo)心肌細胞損傷，給予白藜蘆醇預(yù)處理觀察對心肌細胞凋亡的影響，及其對硫氧還蛋白系統(tǒng)的影響。
　　材料與方法
　　1.乳鼠心肌細胞的分離與培養(yǎng)以及實驗分組
　　將培養(yǎng)48h的乳

5、鼠心肌細胞分為三組：1）正常對照組：使用含葡萄糖5.5mmol/L的DMEM培養(yǎng)基加入甘露醇20mmol/L作為對照培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；2）高糖組：使用含葡萄糖25mmol/L的DMEM培養(yǎng)基作為高糖培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；3）高糖+白藜蘆醇組：使用含葡萄糖25mmol/L的DMEM培養(yǎng)基加入終濃度30μmol/L的白藜蘆醇對細胞進行45min預(yù)處理后換25mmol/L高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，各組細胞均繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細胞及培養(yǎng)基上清進行指標(biāo)測定。

6、
　　2.指標(biāo)檢測
　　測定培養(yǎng)基上清中乳酸脫氫酶（LDH）活性反映心肌細胞損傷情況，以標(biāo)記了FITC的AnnexinV作為熒光探針利用流式細胞儀檢測細胞凋亡程度，以胰島素還原法測定心肌細胞中Trx活性，使用ELISA對細胞內(nèi)3-硝基酪氨酸（3-NT)生成進行測定，以Real-timePCR法測定心肌細胞TXNIP的mRNA水平，以WesternBlot法測定心肌細胞Trx1和TXNIP的蛋白表達，以DCFH-DA作為熒光探

7、針使用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛（MDA）含量以反映脂質(zhì)氧化水平。
　　結(jié)果
　　1.乳鼠心肌細胞培養(yǎng)48h后形態(tài)學(xué)觀察
　　接種48h后細胞形成細胞簇或細胞單層，貼壁細胞呈梭形、多角形，通過周邊突起的偽足相互交聯(lián)，鋪滿瓶底，呈放射狀排列的同心圓狀或峰谷樣生長，細胞搏動逐漸同步，收縮有力，于72h達高峰。
　　2.乳酸脫氫酶（LDH）活性測定
　　經(jīng)檢測，與正常對

8、照組心肌細胞相比，高糖組乳鼠心肌細胞的乳酸脫氫酶活性增高（1.978±0.609vs1±0.321,P<0.05），提示高糖可引起心肌細胞損傷；而白藜蘆醇預(yù)處理組，乳酸脫氫酶活性下降（1.105±0.305vs1.978±0.609,P<0.05），表明白藜蘆醇預(yù)處理能明顯減輕高糖對細胞的損傷。
　　3．流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡
　　結(jié)果顯示，與正常對照組心肌細胞相比，高糖組乳鼠心肌細胞凋亡明顯增加(24.075±5.05

9、2vs9.993±1.971,P<0.05），給予白藜蘆醇預(yù)處理后凋亡減少(10.104±1.483vs24.075±5.052,P<0.05)，表明白藜蘆醇對高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡具有保護作用。
　　4．Trx活性分析
　　經(jīng)檢測，與正常對照組心肌細胞相比，高糖組乳鼠心肌細胞Trx活性顯著降低(0.41±0.032vs1±0.025,P<0.05)，給予白藜蘆醇預(yù)處理后高糖引起的Trx活性下降明顯得以改善(1.23±0.1

10、33vs0.41±0.032,P<0.05)。
　　5．Trx相對表達
　　結(jié)果顯示，與正常對照組心肌細胞相比，高糖組和白藜蘆醇預(yù)處理組乳鼠心肌細胞Trx1蛋白表達均未見明顯變化(1.001±0.018,0.832±0.03vs1±0.023,P>0.1)。
　　6.TXNIP相對表達
　　經(jīng)檢測，與正常對照組心肌細胞相比，高糖組乳鼠心肌細胞TXNIP表達明顯增高(1.41±0.08vs1±0.125,P<0.0

11、5),給予白藜蘆醇預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了由高糖引起的TXNIP表達的改變(0.987±0.163vs1.41±0.08,P<0.05)。
　　7.TXNIPmRNA表達
　　經(jīng)檢測，與正常對照組心肌細胞相比，高糖組乳鼠心肌細胞在培養(yǎng)48h后，TXNIPmRNA水平顯著增加(12.873±1.726vs1.00±0.00,P<0.05)，給予白藜蘆醇預(yù)處理后TXNIPmRNA水平明顯降低(8.406±0.811vs12.873±1.72

12、6,P<0.05)。
　　該結(jié)果提示，給予白藜蘆醇預(yù)處理能有效逆轉(zhuǎn)由高糖引起的心肌細胞TXNIPmRNA水平的增加。
　　8．3-硝基酪氨酸含量測定
　　經(jīng)檢測，與正常對照組心肌細胞相比，高糖組乳鼠心肌細胞內(nèi)3-硝基酪氨酸含量升高(16.978±0.20vs7.876±1.574,P<0.05)，給予白藜蘆醇預(yù)處理后3-硝基酪氨酸含量降低(12.041±0.429vs16.978±0.20,P<0.05)。
　　

13、9．p38激酶活性分析
　　結(jié)果顯示，與正常對照組心肌細胞相比，高糖組乳鼠心肌細胞p38激酶活性增高(1.437±0.09vs1±0.157,P<0.05)，給予白藜蘆醇預(yù)處理后p38激酶活性降低(0.84±0.094vs1.437±0.09,P<0.05)。
　　10.活性氧（ROS）生成測定
　　經(jīng)檢測，與正常對照組心肌細胞相比，高糖組乳鼠心肌細胞在培養(yǎng)48h后，細胞內(nèi)活性氧生成顯著增加(1.59±0.141vs1

14、±0.179,P<0.05)，給予白藜蘆醇預(yù)處理后活性氧生成量降低(0.61±0.08vs1.59±0.141,P<0.05)。
　　該結(jié)果提示，給予白藜蘆醇預(yù)處理能明顯減少由高糖引起的心肌細胞內(nèi)活性氧生成.
　　11．丙二醛（MDA）測定
　　經(jīng)檢測，與正常對照組心肌細胞相比，高糖組乳鼠心肌細胞在培養(yǎng)48h后，細胞內(nèi)MDA水平顯著增加(9.13±1.16vs5.83±0.178,P<0.05)，給予白藜蘆醇預(yù)處理后M

15、DA水平明顯降低(4.06±0.38vs9.13±1.16,P<0.05)。
　　該結(jié)果提示，給予白藜蘆醇預(yù)處理能有效減輕高糖誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化損傷。
　　結(jié)論
　　1.高糖可引起培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞發(fā)生損傷和凋亡，伴隨自由基產(chǎn)生、脂質(zhì)氧化損傷和Trx系統(tǒng)改變，Trx活性降低、TXNIP表達上調(diào)。
　　2.白藜蘆醇預(yù)處理可使Trx活性得到改善，高糖引起的TXNIP的表達明顯下調(diào)，細胞內(nèi)活性氧生成、MDA含量、3-硝基