不同亞型ApoE對創(chuàng)傷后神經(jīng)元-星型膠質(zhì)細胞繼發(fā)性損傷的影響及機制探討.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是神經(jīng)外科最常見的疾病之一，被認為是全世界45歲以下人群中最具威脅的致殘、致死因素，并且給家庭和社會帶來巨大的痛苦和經(jīng)濟損失，已經(jīng)成為一個全球性的社會經(jīng)濟問題。TBI發(fā)生后的損傷包括：原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，由于原發(fā)性損傷往往無法進行干預，而繼發(fā)性損傷卻因為眾多因素參與，具有多個干預靶點，所以繼發(fā)性損傷過程被認為是影響TBI預后的關鍵。本課題關注的載脂蛋白E基因(apo

2、lipoprotein E gene，APOE)位于19號染色體長臂，編碼腦組織中最主要的載脂蛋白--載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)。APOE共含4個外顯子，主要存在三個等位基因：APOEε2，APOEε3，APOEε4，分別編碼三種不同的ApoE，即ApoE2、ApoE3和ApoE4。這三種ApoE分子構成的差別雖然僅限于第112和158位氨基殘基不同，但是卻導致3種亞型ApoE的生物學功能出現(xiàn)了明顯的差異。

3、ApoE4被認為是功能異常的蛋白，常常扮演負性調(diào)控因子的角色，而ApoE2和ApoE3的功能則相對正常。作為腦組織最主要的載脂蛋白，ApoE不僅在脂質(zhì)轉運和代謝中發(fā)揮作用，還參與神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞的生長和修復、細胞信號傳導等過程。我們的前期研究和國內(nèi)外文獻都證實APOE基因多態(tài)性能夠影響TBI的預后，但是具體機制尚不完全清楚。因此，本課題在前期工作的基礎上，以不同亞型ApoE蛋白在TBI后繼發(fā)性損傷過程中的作用為切入點，通過培養(yǎng)原代神

4、經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞并構建機械損傷模型，檢測不同亞型ApoE對細胞內(nèi)鈣離子水平([Ca2+]i)、神經(jīng)元內(nèi)線粒體功能以及星型膠質(zhì)細胞釋放谷氨酸的影響，觀察不同亞型ApoE對機械損傷后星型膠質(zhì)細胞活性和修復能力的影響以及與受體ApoER2的親和力，并探討不同亞型ApoE在TBI后的繼發(fā)性損傷過程中發(fā)揮的作用及可能方式，以期闡明APOE基因多態(tài)性影響TBI預后可能的機制。
　　一、原代神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)以及機械損傷模型的建立

5、r>　　神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞在腦組織的功能和結構中發(fā)揮極其重要的作用，所以對神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞進行體外培養(yǎng)，建立穩(wěn)定的培養(yǎng)模型，對神經(jīng)科學研究至關重要；而體外神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞機械損傷模型可控性強，并能在一定程度上模擬TBI后的繼發(fā)性損傷過程，適合進行機制方面的研究。方法：1.本部分實驗提取出生24小時內(nèi)的APOE基因敲除小鼠(APOE-/-)的腦組織，采取酶消化法獲取細胞懸液后，分別進行神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)。其中，神經(jīng)元的培

6、養(yǎng)基為neurobasal+B27，星型膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)基為DMEM/F12+胎牛血清。2.在進行神經(jīng)元/星型膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)時，先用傳代3次的星型膠質(zhì)細胞作為滋養(yǎng)層，讓其長滿培養(yǎng)皿底部，然后將提取的原代細胞直接接種在星型膠質(zhì)細胞滋養(yǎng)層上，按照2:1的比例加入兩種培養(yǎng)基(neurobasal+B27和DMEM/F12+胎牛血清)。細胞培養(yǎng)一段時間后，取狀態(tài)較好的細胞，分別選用抗GFAP和抗TubulinⅢ的抗體對星型膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元進行標記

7、，采用免疫熒光技術對細胞進行鑒定。3.采用移液槍槍頭作為劃傷工具，執(zhí)移液槍，在顯微鏡下對培養(yǎng)皿底部的細胞進行劃傷，并通過光學顯微鏡觀察細胞劃傷情況。結果：1.光鏡顯示，一種細胞呈“鋪路石”樣排列，胞體較大呈不規(guī)則形，通過免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)細胞能被抗GFAP的抗體識別；另一種細胞胞體較小，多呈梭形，有很多較長的突起，且與其它細胞的突起相互交錯，形成網(wǎng)絡狀，通過免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)細胞能被抗TubulinⅢ的抗體識別。2.采用免疫雙標對細胞進

8、行標記后，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細胞中部分細胞能被抗GFAP的抗體識別，另一部分細胞能被抗TubulinⅢ的抗體識別，兩種細胞相互共存。3.光鏡下可見由機械損傷造成的劃痕，用移液槍槍頭進行機械劃傷可控性好。結論：本部分實驗，成功進行了神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)以及神經(jīng)元/星型膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)，并且成功構建了細胞的機械損傷模型。
　　二、不同亞型ApoE對機械損傷后星型膠質(zhì)細胞釋放谷氨酸和神經(jīng)元線粒體膜電位以及細胞內(nèi)鈣離子的影響及可能機制

9、r>　　[Ca2+]i的變化在TBI后繼發(fā)性損傷過程中發(fā)揮極其重要的作用，而細胞外液中興奮性氨基酸的濃度以及細胞內(nèi)線粒體的功能變化均可能與[Ca2+]i改變有關。不同亞型的ApoE則可能通過參與這些過程，不同程度地影響[Ca2+]i。方法：本部分實驗將神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞按照加入的ApoE均分為ApoE2組、ApoE3組、ApoE4組和沒有加入ApoE的對照組，并進行機械劃傷，觀察機械損傷后不同時間點各個指標的變化情況：1.收集機械損傷

10、后1h、2h、6h以及未進行機械損傷的星型膠質(zhì)細胞的細胞外液，通過氨基酸自動分析儀檢測各組星型膠質(zhì)細胞外液中Glu的水平。2.采用熒光探針JC－1對神經(jīng)元線粒體進行標記，通過流式細胞術檢測機械損傷后1h、2h、6h、12h、24h，以及未進行機械損傷的各組神經(jīng)元內(nèi)紅色和綠色兩種熒光的熒光強度比值的變化。3.采用鈣離子熒光探針Fluo－3/AM對活細胞內(nèi)鈣離子進行標記，選擇488nm的激發(fā)波長激發(fā)Fluo-3，在激光共聚焦顯微鏡下觀察機械

11、損傷后1h、2h、6h、12h、24h以及未進行機械損傷的各組神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞內(nèi)鈣離子熒光強度的變化。結果：1.在機械損傷2h后，加入不同亞型ApoE的星型膠質(zhì)細胞外液中Glu水平開始出現(xiàn)差異：ApoE4組的星型膠質(zhì)細胞外液中Glu水平明顯高于ApoE2組和ApoE3組。2.在機械損傷各個時間點，加入不同亞型ApoE的神經(jīng)元線粒體膜電位變化存在差異，ApoE4組的神經(jīng)元內(nèi)線粒體膜電位下降程度明顯高于ApoE2組和ApoE3組。3.在

12、機械損傷后各個時間點，ApoE4組的神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞內(nèi)鈣離子熒光強度均明顯高于ApoE2組和ApoE3組。結論：機械損傷發(fā)生后，不同亞型的ApoE蛋白可導致神經(jīng)元和星型膠質(zhì)[Ca2+]i出現(xiàn)不同變化，而這些差異有可能與ApoE對星型膠質(zhì)細胞釋放Glu和神經(jīng)元線粒體膜電位的影響存在亞型特異性有關，這也可能是APOE基因多態(tài)性影響TBI預后的機制之一。
　　三、不同亞型ApoE對星型膠質(zhì)細胞修復能力和活性的影響以及與ApoER2的

13、結合情況
　　星型膠質(zhì)細胞在腦組織中的作用意義重大，其活性和增殖以及修復能力能夠?qū)BI后的繼發(fā)性損傷過程產(chǎn)生重要影響。同時，ApoE作為腦組織中最主要的載脂蛋白，能夠與LDL受體家族的所有成員，包括LDLR、LRP、VLDLR和ApoER2等進行結合，并通過這些受體發(fā)揮作用。方法：本部分實驗將神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞按照加入的ApoE蛋白均分為ApoE2組、ApoE3組、ApoE4組和沒有加入ApoE蛋白的對照組：1.對各組星型膠質(zhì)

14、細胞進行機械劃傷，并做好標記，在傷后24h、48h、72h進行定點照相，觀察各組星型膠質(zhì)細胞對損傷區(qū)域的修復情況，并采用MTT檢測各組星型膠質(zhì)細胞的活性和增殖能力。2.采用免疫雙標，分別用抗ApoER2的抗體和抗ApoE的抗體對神經(jīng)元上的ApoER2和ApoE進行標記，通過激光共聚焦顯微鏡對二者熒光情況進行合成和檢測，判斷不同亞型ApoE蛋白與ApoER2結合的情況是否存在差異。結果：1.ApoE4.組的星型膠質(zhì)細胞活性和增殖以及修復能