靜脈注射用治療基因靶向傳遞系統(tǒng)的研究.pdf

1、隨著人類基因組計劃的完成和人類疾病相關基因的闡明，疾病的基因治療備受矚目?；蛑委煹年P鍵問題之一在于開發(fā)安全、高效的基因傳輸系統(tǒng)。目前，基因傳輸系統(tǒng)主要分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。病毒載體雖然具有較高的基因傳遞效率，但其臨床應用存在著毒性和免疫原性等問題。因此，非病毒載體系統(tǒng)的研究成為另一重要的發(fā)展方向。非病毒載體具有使用方便、可大規(guī)模生產以及無免疫原性等優(yōu)點，其中陽離子脂質體是研究應用得最為廣泛的非病毒載體。但由于陽離子脂質體在

2、體內的穩(wěn)定性和靶向性較差，常常只能采取局部注射的給藥方式。 為了構建一種可供靜脈內注射的、具有靶向傳輸作用的基因載體，本文設計用由海洋魚類提取的天然產物魚精蛋白，作為聚陽離子材料縮聚質粒DNA，再讓脂質體與縮聚后的DNA相互作用，從而使脂質雙層重新排列，最終形成結構緊密的脂質-聚陽離子-DNA復合物(Lipid-polycation-DNAcomplexes，LPD)。 本研究中我們利用微生物發(fā)酵的方法大量培養(yǎng)轉化有

3、質粒的大腸桿菌，并采用陰離子柱層析的方法分離純化質粒。采用紫外分光光度法和凝膠電泳法對質粒的純度和含量進行了測定，純度符合要求。我們建立了用熒光染料Hoechst33258來測定制劑中DNA含量的方法。采用薄膜-擠壓法制備空白脂質體，然后與適量的魚精蛋白-DNA復合物在室溫孵育后，得到LPD；分別用單因素法和中心組合法優(yōu)化了陽離子型LPD和陰離子型LPD的處方。 為了提高陽離子型LPD的物理化學及生物學穩(wěn)定性，我們將其制備成凍

4、干針劑。凍干后的LPD可以保持其結構的完整性。凍干后的LPD針劑外觀飽滿疏松，色澤均勻，表面細膩光潔，具有足夠的強度；其粒徑為132.5nm，Zeta電位為44.35mV，包封率為93.61％，微粒的形態(tài)和pH值無明顯改變，而且再分散性良好。另外，陽離子LPD經凍干后能保持其抗核酸酶能力和轉染活性。 在體外細胞的轉染實驗中，我們以易于檢測的報告基因為工具，對我們構建的LPD在體外細胞中的表達效率與裸DNA和商品化脂質體載體進行

5、了比較研究。結果表明LPD在人肺癌A431細胞中的轉染率為36.25±5.02(mU/mg蛋白)，明顯高于Lipofectamine，在人肝癌SMMC-7721和HepG2細胞中的轉染率分別為18.71±1.36和28.84±3.62(mU/mg蛋白)；而裸DNA在各株細胞中的轉染率均極低。 小鼠體內的轉染實驗表明，靜脈注射裸質粒后，小鼠的心、肝、脾、肺和腎五個臟器均未發(fā)現藍染的陽性細胞；而靜脈注射LPD凍干針劑后，除心臟外，

6、其它幾個器官均有藍染的陽性細胞，并且發(fā)現LacZ在肺臟和脾臟有較強的表達，尤其是在肺的支氣管上皮。 我們還進一步考察了陽離子LPD(pORF-mIL12)的抗腫瘤活性。在C57BL/6小鼠腋下接種LL2肺癌細胞，構建小鼠的肺癌模型，尾靜脈注射陽離子LPD(pORF-mIL12)后，觀察其抗腫瘤活性。初步實驗表明，LPD與順鉑聯合使用能提高療效、降低順鉑的毒性、延長小鼠的生存期。 為了提高載基因脂質納米粒的肝靶向性，我

7、們利用肝細胞表面的去唾液酸糖蛋白受體的識別作用，合成了一系列膽固醇的半乳糖衍生物，制備了帶有不同半乳糖配體的LPD轉染系統(tǒng)，并用SMMC-7721和HepG2細胞對這些化合物的肝細胞靶向性進行了篩選。結果表明，半乳糖殘基與其母體分子之間的空間距離(Spacer)，是ASGP-R識別半乳糖配體的重要決定因素之一，我們所合成的化合物1c具有較優(yōu)的肝細胞靶向性。 本文研究結果表明，LPD是一種制備工藝簡單、穩(wěn)定性好、可供靜脈注射用的