DICER在白血病中的功能及GATA-1對其調(diào)控機制的研究.pdf

1、急性白血病是我國常見十大惡性腫瘤之一，它是造血干細胞的惡性克隆性疾病，其克隆中的白血病細胞失去進一步分化成熟的能力而停滯在細胞發(fā)育的不同階段。在骨髓和其他造血組織中白血病細胞大量增生積聚并浸潤其他器官和組織，同時使正常造血受抑制，臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染及各器官浸潤癥狀。一般可根據(jù)白血病細胞系列歸屬分為急性髓系白血病(AML)和急性淋巴細胞白血病(ALL)兩大類。在成年人中AML是最常見的類型。急性白血病進展迅速，如不治療，從起病至死

2、亡的平均時間為2-4個月。一直以來人們不斷探索白血病的發(fā)病機制，從而改善白血病患者的預后。傳統(tǒng)意義上，白血病是遺傳改變的結果，包括非隨機的染色體易位改變，如AML的4種最常見易位改變:t(15;17)/PML/RARα融合基因;t(8;21)/AML1-ETO融合基因;Inv(16)/(CBF)b-MYH11融合基因;11q23/MLL融合蛋白。這些細胞遺傳學異常改變導致與增生、分化、凋亡相關的基因不可逆損傷和白血病相關基因的轉錄異常。

3、近年來，大量研究表明表觀遺傳改變參與白血病的形成和發(fā)展，其中一些改變可能是早期診斷、預后評估以及預測治療效果的標志，其中miRNA表達標簽在上述作用中更有價值，可能成為白血病治療的有效靶點。DICER是miRNA形成過程中的關鍵酶。
　　 DICER是RnaseⅢ（核酸內(nèi)切酶）家族成員，在人類只有DICER1一種，DICER1基因定位于14q32.2，包括28個外顯子，全長52.3kb，在各種組織中廣泛表達。DICE1能同時將d

4、sRNA和miRNA前體加工成siRNA和成熟miRNA，因此是RNAi機制信號通路中的一種關鍵酶。已有研究發(fā)現(xiàn)在不同腫瘤中（如在子宮內(nèi)膜腺癌、卵巢癌等癌癥中DICER1表達水平下調(diào);而在前列腺癌、直腸癌中DICER1表達水平上調(diào)）及腫瘤的不同發(fā)展階段DICER1的表達水平不同，且與疾病的預后相關，而DICER1與血液系統(tǒng)腫瘤的研究鮮有報道。目前僅有Martin等報道了71例初診AML病人中DICER1高表達，但未對其功能及調(diào)控機制進行

5、研究。因此，本研究檢測AML患者和白血病細胞系中DICER1表達水平，并通過RNAi實驗檢測DICER1對白血病細胞增殖、凋亡的影響。通過對DICER15'旁側區(qū)1300bp(-1200～+100)的序列進行預測發(fā)現(xiàn)在這段序列內(nèi)含有潛在的GATA-1結合位點，我們推測DICER1在AML中的表達可能受到轉錄因子GATA-1的調(diào)控。GATA-1是造血系統(tǒng)特有的轉錄因子，其單獨誘導多能造血干細胞向紅細胞系列和巨核細胞系列分化;研究表明GAT

6、A-1在白血病細胞系及AML患者中表達，提示GATA-1可能與AML發(fā)生發(fā)展相關。通過EMSA、CHIP等實驗鑒定GATA-1是DICER1啟動子區(qū)重要的調(diào)控元件，為揭示DICER1在白血病發(fā)病機制中的作用提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法
　　 一、實驗材料
　　 1、人白血病細胞系K562，HL-60;人胚腎細胞系HEK293
　　 2、臨床白血病患者及正常對照者的骨髓標本
　　 3、Real-

7、time PCR及Western印跡雜交實驗相關試劑
　　 4、細胞增殖、凋亡實驗相關試劑
　　 5、基因克隆及螢光素酶報告基因檢測相關試劑
　　 6、電泳泳動遷移實驗及染色質(zhì)免疫沉淀相關試劑
　　 二、實驗方法
　　 1、Real-time PCR和western-blotting檢測AML患者的骨髓標本中DICER1表達水平。
　　 2、Real-time PCR和Western-bl

8、otting檢測DICER1在白血病細胞系中的表達。
　　 3、MTT實驗與細胞凋亡實驗分別檢測DICER1干擾后對白血病細胞增殖與凋亡的影響。
　　 4、Real-time PCR方法檢測DICER1干擾后白血病細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達水平。
　　 5、RT-PCR及Western-blotting檢測AML患者的骨髓標本中GATA1的表達水平。
　　 6、RT-PCR及Wes

9、tern-blotting檢測白血病細胞系中GATA1的表達水平。
　　 7、生物信息學軟件分析DICER1啟動子結構并檢測其活性;
　　 應用TRANSFAC-TESS軟件，對DICER1基因5'旁側序列1300bp(-1200～+100)的序列進行預測，發(fā)現(xiàn)一個潛在的GATA-1結合位點(-617～-611)。構建系列截短的DICER1啟動子螢光素酶報告基因載體，應用螢光素酶檢測系統(tǒng)分析各段啟動子的活性。
　　

10、 8、ChIP實驗驗證在體內(nèi)條件下GATA-1與預測的DICER1啟動子區(qū)GATA-1反應元件結合。
　　 9、EMSA實驗體外鑒定DICER1啟動子區(qū)GATA-1反應元件。
　　 10、Real-time PCR及Western-blotting檢測GATA1干擾后DICER1 mRNA和蛋白表達水平。
　　 11、MTT實驗及細胞凋亡實驗檢測GATA-1干擾后對白血病細胞功能的影響。
　　 結果：<

11、br>　　 1、急性髓細胞白血病患者的骨髓標本中DICER1表達水平顯著高于正常對照組(P＜0.05);
　　 2、白血病細胞系中DICER1的表達水平明顯高于HEK293細胞(P＜0.05);
　　 3、DICER1-shRNA轉染白血病細胞K562、HL-605天后，DICER1 mRNA和蛋白表達水平顯著下降，干擾效果明顯(P＜0.05);
　　 4、MTT實驗結果證明:與對照組細胞相比，DICER1干擾

12、后白血病細胞增殖力顯著降低(P＜0.05);流式細胞分析表明:與正常細胞和對照組細胞比較，DICER1干擾后白血病細胞凋亡顯著增加(P＜0.01);
　　 5、Real-time PCR結果表明DICER1干擾后白血病細胞K562、HL-60中Caspase-3、Bax表達顯著增加(P＜0.05)，Bcl-2表達顯著下降(P＜0.05)。
　　 6、急性髓細胞白血病患者的骨髓標本中GATA-1表達水平顯著高于正常對照組(

13、P＜0.05);
　　 7、白血病細胞系中GATA-1的表達水平顯著高于HEK293細胞(P＜0.05);
　　 8、生物信息學軟件分析預測DICER1啟動子區(qū)存在潛在的GATA-1結合位點(-617～-611);螢光素酶報告基因結果表明在DICER1上游-652到-489區(qū)間內(nèi)存在正調(diào)控元件;
　　 9、ChIP實驗結果證明體內(nèi)條件下GATA-1與DICER1啟動子區(qū)的結合
　　 10、EMSA實驗證明

14、體外條件下GATA-1特異性結合DICER1啟動子區(qū)GATA-1反應元件;
　　 11、RT-PCR及Western-blotting證明GATA-1干擾后DICER1 mRNA和蛋白表達水平下降;
　　 12、MTT實驗結果表明GATA-1干擾后白血病細胞增殖力減弱;
　　 13、流式細胞分析表明GATA-1干擾后白血病細胞凋亡增加。
　　 結論：
　　 1.DICER1在急性髓細胞白血病中高表