谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的定點(diǎn)突變及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、蛋白質(zhì)-谷氨酸-γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（EC2.3.2.13），即谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（簡(jiǎn)稱TGase、TG），它能催化谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基發(fā)生轉(zhuǎn)移，促使蛋白分子內(nèi)部及分子間的發(fā)生交聯(lián)，可改善蛋白結(jié)構(gòu)，提高物質(zhì)的彈性，保持蛋白的營(yíng)養(yǎng)，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域具有非常高的實(shí)用價(jià)值。
　　谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的來源廣泛，動(dòng)物來源的TG需要Ca2+來暴露其活性區(qū)的半胱氨酸殘基位點(diǎn)，且獲取工藝較為復(fù)雜昂貴，相較之下，微生物來源的T

2、G（Microbial transglutaminase，簡(jiǎn)稱MTG）來源廣泛，生產(chǎn)周期短，不依賴Ca2+，酶的熱穩(wěn)定性更高、催化能力更強(qiáng)，更適合工業(yè)生產(chǎn)。
　　本文是筆者對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的一株從土壤中分離得到的吸水鏈霉菌H197菌株的TG基因序列的分析，編碼區(qū)基因大小為1257bp，編碼417個(gè)氨基酸，GC含量為61.4％，分子量約為46.6kDa，pI為7.08。根據(jù)其三維空間結(jié)構(gòu)的特征，設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)，將酶活中心三聯(lián)體Cys151

3、-Asp342-His361中361位His(CAC)突變成Lys(AAA)。
　　設(shè)計(jì)突變引物，以重組質(zhì)粒pET-22b(+)-MTG為模板，利用重疊延伸PCR技術(shù)定點(diǎn)突變，構(gòu)建含突變位點(diǎn)的突變重組質(zhì)粒pET-22b(+)-MTG-M，并轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）。菌落PCR及酶切驗(yàn)證后測(cè)序，結(jié)果顯示：第1090位的C突變成A，第1092位的C突變成A，即His(CAC)成功突變成Lys(AAA)。獲得兩株重組菌株，即

4、突變型pET-22b（+）-MTG-M-E.coli BL21(DE3)（命名為p-B-M-M）和野生型pET-22b（+）-MTG-E.coli BL21(DE3)（命名為p-B-M）。
　　對(duì)兩種重組菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)小量表達(dá)，測(cè)定蛋白濃度及粗酶活。突變型蛋白濃度為7.69 g/L，粗酶活力為0.437U/mL，野生型蛋白濃度為7.93 g/L，粗酶活力為0.425U/mL，兩者酶活沒有顯著性差異(T檢驗(yàn)P>0.05)。表明H

5、is位點(diǎn)的改變并不影響 MTG蛋白的表達(dá)力和酶的催化活力。從誘導(dǎo)條件來看，8-12h是誘導(dǎo)表達(dá)的最佳時(shí)間，誘導(dǎo)時(shí)間過長(zhǎng)反而不利于MTG蛋白的表達(dá)；當(dāng)IPTG濃度為0.8g/L時(shí)，MTG表達(dá)量最大，過高的IPTG濃度對(duì)MTG蛋白的表達(dá)反而有著一定的抑制作用；30℃時(shí)，MTG蛋白的表達(dá)達(dá)到最大值。
　　通過鎳柱對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白進(jìn)行親和層析純化，野生型菌株比活力由純化前的0.056U/mg升到3.28U/mg，突變型菌株比活力由純化前的

6、0.053U/mg變?yōu)?.38U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到近60倍。野生型蛋白酶液可在pH5-9的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，而突變型的穩(wěn)定只能維系在pH為6-8范圍內(nèi)，兩者均在pH為7.0時(shí)酶活最穩(wěn)定；MTG酶液在20℃-40℃保溫30min時(shí)，其酶活力損失較小，而在高于50℃保溫30min會(huì)失去幾乎所有的活性，說明其熱穩(wěn)定不高，相較于野生型，突變體酶的熱穩(wěn)定性更差；除Ni+和Cu2+對(duì)酶活力有較大抑制，其它供試金屬離子對(duì)MTG酶活力抑制均較小。