黃爬表皮毛相關基因的定位、同源克隆與功能研究.pdf

1、果實刺瘤是黃瓜（Cucumis sativus L.）重要的外觀品質之一。組織學觀察發(fā)現黃瓜表皮毛和果刺均為多細胞非腺體的柱狀結構。黃瓜無毛突變體glabrous(l)(gl1)的莖、葉、卷須、花萼、子房均沒有表皮毛，果實表面也沒有果刺和果瘤，是研究黃瓜表皮毛及果實刺瘤形成機理的理想材料。遺傳分析結果表明無毛基因(gl1)對控制果瘤性狀的果瘤基因(Tu)存在隱性上位作用。因此，研究黃瓜表皮毛形成的分子機制有助于探明黃瓜果實刺瘤的形成機制

2、。另外，表皮毛和果刺是由表皮細胞分化而來，而表皮細胞是研究植物細胞分化最好的模型，因此，對黃瓜表皮毛的形成機制的研究有助于豐富植物細胞分化理論。
　　 本研究用歐洲溫室型黃瓜“壯瓜”與無毛突變體gl1雜交構建了F2群體，利用無毛表型的F2單株為定位群體，進行圖位克隆以分離出無毛基因。同時，還利用生物信息學的方法分析了黃瓜中的R2R3MYB，bHLH，WD40-repeat和R3 single repeat MYB基因家族的所有成

3、員，并利用同源進化分析找出黃瓜中可能和表皮毛形成相關的同源基因。為了研究這些同源基因的功能，還進行了擬南芥和黃瓜的遺傳轉化。研究結果如下:
　　 1.共篩選了322對SSR標記，找到了在無毛突變體和壯瓜之間具有多態(tài)的SSR標記21個，并將無毛基因gl1定位在3號染色體上的SSR21054和SSR117之間。這兩個標記之間的物理距離為3000Kb。根據無毛突變體的基因組重測序信息，在初步定位區(qū)間內找到了在雙親之間有多態(tài)的2個STS

4、標記和3個CAPS標記。通過對2400棵無毛表型的F2單株進行標記分析，將gl1基因定位在STS-1和CAPS-1之間，物理距離約311K(28801842-29113539)的區(qū)間內，共有52個候選基因。通過對候選基因的注釋及與擬南芥同源基因的比較分析發(fā)現，這52個基因中沒有與細胞分裂、細胞周期或表皮細胞命運決定相關的同源基因。所以，黃瓜表皮細胞的分化機制很有可能與擬南芥有不同之處。
　　 2.通過數字基因表達譜(DGE)對無

5、毛突變體及其親本的葉片進行了差異表達基因分析。與親本相比，在無毛突變體葉片中表達量下調的基因365個，上調的基因139個。其中差異倍數在20倍以上的基因共57個。GO功能富集分析表明，這些差異表達基因主要參與代謝作用、細胞過程、刺激應答、及細胞機構合成等相關生物學過程。
　　 3.在黃瓜全基因組中，利用BlastP的方法分析了R2R3MYB，bHLH，WD40-repeat和R3 single repeat MYB基因家族，分別

6、找到了46個R2R3MYB基因，138個bHLH基因，191個WD40-repeat基因及1個R3 single repeat MYB基因。利用同源進化分析找到了擬南芥中TTG1，MYC1和TRY的同源基因，分別命名為CsTTG1，CsMYC1和CsTRY。另外，黃瓜的R2R3MYB基因家族中沒有與表皮細胞命運決定相關的基因，但找到了一個與擬南芥GL1同源性最高的R2R3MYB基因，命名為CsGL1-like(CsGL(1)L)。序列分

7、析表明，CsGL1L，CsMYC1， Cs TTG1及CsTRY的CDS長度分別為783bp，1956，1002和249bp，分別編碼260，651，333和82個氨基酸。
　　 4.為了分析CsGL1L，CsMYC1， CsTTG1及CsTRY的亞細胞定位情況，分別構建了CsGL1L，CsMYC1， CsTTG1及CsTRY與GFP的融合蛋白。共聚焦結果顯示CsGL1L，CsMYC1， CsTTG1及CsTRY均定位在洋蔥表皮

8、的細胞核中。
　　 5.組織特異性分析結果表明，CsGL1L, CsMYC1， CsTTG1及CsTRY在黃瓜的各組織中均有不同程度的表達。其中CsGL1L主要在果實中表達，CsMYC1在根、莖、葉、花和果實中表達量均較高，只在卷須中表達量較低。CsTTG1在各個組織器官中表達量均較高。CsTRY主要在葉片，根和卷須中表達量高，在莖、雄花和果實中表達量較低。
　　 6.為了分析CsGL1L，CsMYC1，Cs TTG1及

9、CsTRY的功能，分別構建了這四個基因的過表達及RNAi載體。擬南芥的遺傳轉化實驗表明，在擬南芥gl1突變體中過表達CsGL1L沒有恢復gl1突變體有毛的表型。在野生型擬南芥Co(l)中分別過表達CsGL1L和CsMYC1可以使轉基因植株蓮座葉上的表皮毛數量顯著增加，但過表達CsTTG1后，轉基因植株蓮座葉上的表皮毛數量與野生型相比沒有明顯的變化。
　　 7.為了進一步分析CsGL1L，CsMYC1， CsTTG1及CsTRY在