中心蛋白C端半分子及其磷酸化性質的研究.pdf

1、中心蛋白(centrin)是一種分子量大約為20 kDa的中心體常駐蛋白，它與細胞內纖維收縮、細胞分裂及紡錘體的分離等密切相關。在細胞內，蛋白質可逆磷酸化是一種重要的共價翻譯后修飾(PTMs)，為生物體內的信號轉導和細胞調節(jié)起到重要作用。因此其在機體內的磷酸化與去磷酸化行為，為細胞內外信號轉導提供了一個重要的調控機制。
　　 每個中心蛋白分子均含有四個結構域，每一個結構域可以結合一個金屬離子，其中Ⅰ、Ⅱ結合位點位于蛋白的N端結構

2、域;Ⅲ、Ⅳ結合位點位于蛋白的C-端結構域。本文選用中心蛋白C-端半分子(C-EoCen)為研究對象，著重研究了由蛋白激酶A介導的C-EoCen磷酸化前后同金屬離子之間的相互作用以及化學交聯(lián)的性質。
　　 首先運用分子生物學方法，構建得到了一個基因重組質粒pGEX-6p-C-EoCen，將重組質粒pGEX-6p-C-EoCen轉入大腸桿菌BL21(DE3)中，獲得表達工程菌并挑取單菌落活化、培養(yǎng)誘導，離心收集菌體，超聲裂解液經GS

3、T柱親和層析、PPase酶切、濃縮處理后獲得中心蛋白C-端半分子(C-EoCen)。經SDS-PAGE分析顯示所得蛋白不含有雜蛋白條帶，達到實驗所需純度。
　　 運用熒光光譜、圓二色光譜和紫外差光譜的方法研究C-EoCen與Sm3+的結合。發(fā)現(xiàn)Sm3+與C-EoCen結合后，蛋白質從關閉式構象轉換為開放式構象，蛋白的疏水性結構域外露程度增強;蛋白質的α-螺旋含量明顯增強;Sm3+與C-EoCen的Ⅲ、Ⅳ結合位點的條件穩(wěn)定常數(shù)分別

4、為:lgKⅣ=6.81±0.51，lgKⅢ=6.23±0.39。
　　 Native-PAGE、TNS熒光實驗表明PKA可以催化C-EoCen發(fā)生磷酸化反應;磷酸化修飾后的C-EoCen暴露的疏水面積比磷酸化前的蛋白減少，并發(fā)現(xiàn)金屬離子Ca2+、Tb3+、Gd3+對C-EoCen的磷酸化均有抑制作用，隨著金屬離子的增加抑制作用更為明顯。
　　 利用Native-PAGE、TNS熒光實驗表明，磷酸化前后的中心蛋白C-端半分