利用CRISPR-Cas9技術(shù)對水稻白葉枯病感病相關(guān)基因HW3進行定點修飾及功能分析.pdf

1、由黃單胞桿菌水稻致病變種(Xanthomonas oryzaepv.Oryzae,Xoo)所引起的水稻白葉枯病是全球水稻生產(chǎn)中危害最嚴重的病害之一,能夠引起水稻減產(chǎn)高達50％。一直以來，國內(nèi)外研究重點主要集中于抗病基因，利用寄主的抗性來控制白葉枯病。已經(jīng)鑒定出了42個抗病基因（Xa1到xa41（t）），這些抗病基因中有的抗譜較窄，有的抗性較弱，有的是隱性基因。所以，不斷發(fā)掘新的抗病資源對全世界的水稻生產(chǎn)都具有重要作用。通過利用抗病基因來

2、培育抗白葉枯病的品種并非唯一途徑，近年來研究顯示通過調(diào)控感病基因也能提高水稻對白葉枯病的抗性。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)發(fā)掘了一個水稻白葉枯病的感病基因 HW3，并利用人工核酸酶 CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)等對其進行了功能鑒定，獲得主要研究結(jié)果如下：
　　1.本實驗室前期用白葉枯病強致病菌株P(guān)XO99A接種一對抗感近等基因系，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示一個基因HW3在感病系IR24中高表達而在其抗病近等基因系5024中幾乎不表達。

3、本研究對其進行 qRT-PCR進一步驗證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致，我們推測這個基因可能與感病相關(guān)。
　　2.生物信息學分析表明HW3基因全長1771 bp，有3個外顯子和2個內(nèi)含子，cDNA全長1275 bp，編碼一個含424個氨基酸的未知蛋白。
　　3.通過PCR擴增、測序比對發(fā)現(xiàn)HW3基因在IR24和5024中無論是外顯子還是內(nèi)含子的序列都是相同的。又通過擴增HW3發(fā)現(xiàn)在翻譯起始密碼子ATG上游252 bp處，IR2

4、4和5024之間有一個SNP(single nucleotide polymorphism)的差異。
　　4.構(gòu)建了亞細胞定位表達載體pC1205-YFP-HW3，通過煙草表皮細胞瞬時表達系統(tǒng)，并利用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)HW3蛋白定位在細胞核上。
　　5.在 HW3基因的第一個外顯子上選擇兩個靶位點，構(gòu)建了 CRISPR/cas9植物表達載體pC-HW3。通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化，將pC-HW3轉(zhuǎn)化到IR24品種中

5、，獲得20株T0代轉(zhuǎn)基因植株。
　　6.用PXO99A對T0代轉(zhuǎn)基因植株進行田間剪葉接種鑒定。接種7天時觀察，有4個植株幾乎未發(fā)病;接種15天時觀察，發(fā)現(xiàn)這4個轉(zhuǎn)基因植株的病斑長度與IR24的病斑長度存在顯著差異，表明這4株轉(zhuǎn)基因植株對PXO99A表現(xiàn)抗病。
　　7.對上述4株轉(zhuǎn)基因抗病株及16株轉(zhuǎn)基因感病株的CRISPR靶位點的突變型進行了PCR分子檢測，通過測序分析發(fā)現(xiàn)這4株轉(zhuǎn)基因抗病株在 CRISPR靶位點處發(fā)生的都是

6、雙等位突變（Bi-allelic），并且兩個靶位點處都有突變發(fā)生，而剩余16株轉(zhuǎn)基因感病株在靶位點處并沒有發(fā)生突變。結(jié)果顯示這4株轉(zhuǎn)基因抗病株的抗病表型與HW3基因的剪切突變相關(guān)，也說明HW3是水稻白葉枯病的寄主感病相關(guān)基因。
　　8.對上述4個T0代抗病植株的T1代株系進一步田間接種鑒定與分子檢測，發(fā)現(xiàn)T1的抗病表型與T0代是一致的。分子檢測表明T0代出現(xiàn)的所有CRISPR/Cas9誘導的植株的靶位點突變都能傳遞到T1代。