羔羊胃提取物維B12膠囊對大鼠慢性萎縮性胃炎的治療作用及潛在機制研究.pdf

1、背景：
　　我國的胃癌早期診斷率一直偏低，導致胃癌的治療效果一直不令人滿意，針對胃癌癌前病變進行干預代表著對胃癌積極防御的有效策略。慢性萎縮性胃炎作為胃癌癌前病變的一種，在胃癌的發(fā)展中處于重要的中間環(huán)節(jié)，該階段如能有效治療和干預，實現(xiàn)逆轉，使病變恢復正常，則可能降低胃癌的發(fā)生率。目前對于慢性萎縮性胃炎尚無明確的逆轉方法，這有賴于對其具體發(fā)病機制的進一步深入探究。前期課題組通過全國多中心隨機雙盲安慰劑對照的IV期臨床試驗證明羔羊胃提

2、取物維B12膠囊對于慢性萎縮性胃炎尤其是伴腸化生的病例具有明顯的逆轉效果，為了進一步完善相關證據(jù)，并探索可能涉及的機制，我們以大鼠為模型進行了基礎實驗研究。
　　目的：
　　探索羔羊胃提取物維B12膠囊對于大鼠慢性萎縮性胃炎及腸化生的逆轉效果，并探索其可能涉及的機制。
　　方法：
　　1、綜合文獻報道，通過“MNNG+化學刺激+低酸+不規(guī)律飲食”多種因素的刺激，誘導建立大鼠慢性萎縮性胃炎模型。具體方法為：6周齡的

3、Wistar大鼠隨機分為2組，其中造模組大鼠32只，正常對照組10只，給予造模組Wistar大鼠100μg/ml的MNNG溶液自由飲用,0.03％的雷尼替丁飼料作為食物，每周空腹灌胃1次50%酒精及饑飽失常1次的刺激，共計20周，以建立大鼠慢性萎縮性胃炎的模型，正常組大鼠給予等量生理鹽水灌胃及正常飲食。期間每周1次記錄好大鼠進食飲水量及體重變化等數(shù)據(jù)。造模結束后正常飲食1.5個月，于最后一天饑餓24小時后造模組大鼠處死10只，正常對照組

4、處死5只，收集各組大鼠胃液、血清及胃組織標本，通過檢測各組大鼠胃液pH水平及HE染色、免疫組化染色和AB-PAS染色的方法觀察大鼠胃粘膜病理改變，判斷造模是否成功及病變嚴重程度，為下一步觀察藥物療效實驗打好模型基礎。
　　2、給予羔羊胃提取物維B12膠囊治療階段，將原造模組大鼠（共16只）隨機分為兩組，分別為給藥組和非給藥組，每組8只，另外設造模結束后正常組剩余的5只大鼠為陰性對照組，共計三組。給藥組按照0.02g/100g的體重

5、比例灌胃給予羔羊胃提取物維 B12膠囊藥物溶液，正常對照組及非給藥組均灌胃等量的生理鹽水，各組刺激均持續(xù)3個月完成給藥治療實驗，于最后一天饑餓24小時之后處死各組大鼠收集胃液、血清及胃組織標本，期間每周記錄各組大鼠進食飲水量及體重變化等數(shù)據(jù)。通過對比各組大鼠胃液pH水平變化及HE染色、免疫組化染色和AB-PAS染色的方法觀察各組大鼠胃粘膜病理改變情況，判斷羔羊胃提取物維 B12膠囊對大鼠慢性萎縮性胃炎的治療效果。
　　3、通過相應

6、試劑盒檢測相關血清氧化應激因子（SOD、GSH-Px、MDA）水平變化及Ki-67和Bax免疫組化染色，判斷羔羊胃提取物維B12膠囊逆轉大鼠慢性萎縮性胃炎過程中可能涉及的機制通路，為下一步具體的機制探索指明方向。
　　結果：
　　1、大鼠慢性萎縮性胃炎的成功建立：造模期間，造模組大鼠進食量、飲水量及體重增加值均小于正常對照組，其中體重變化自第4周開始出現(xiàn)統(tǒng)計學差異（造模組240.16±21.62g vs.正常組291.00±

7、35.52g, P＜0.05）。造模結束時，發(fā)現(xiàn)造模組大鼠胃液pH值高于正常對照組大鼠（造模組3.56±0.62 vs.正常組2.01±0.56,P＜0.05）。HE染色顯示，正常對照組大鼠胃竇粘膜固有層腺體豐富，腺體形態(tài)結構正常，未見炎癥細胞浸潤、腺體萎縮或結構異常等病變；造模組大鼠胃竇大小彎側粘膜固有層腺體數(shù)目則顯著減少，腺體結構紊亂，排列失去規(guī)則，大小不一，腺體間隙變寬，出現(xiàn)明顯炎癥細胞浸潤。對兩組大鼠病變進行定量評分統(tǒng)計分析，發(fā)

8、現(xiàn)炎癥（造模組2.30±0.64 vs.正常組0.00±0.00,P＜0.05）、萎縮（造模組2.20±0.63 vs.正常組0.00±0.00,P＜0.05）及腸化生病變（造模組0.70±0.82 vs.正常組0.00±0.00,P＜0.05）的評分均有統(tǒng)計學差異。另外，造模組大鼠粘膜層顯著變薄，黏膜肌層厚度增加，粘膜層與黏膜肌層厚度比值顯著減?。?.34±1.05 vs.2.41±0.77,P＜0.05）。AB-PAS染色結果顯示造

9、模組大鼠腺體密度明顯降低（造模組7.53±2.31 vs.正常組13.43±1.26， P＜0.05）。兩組大鼠出現(xiàn)慢性萎縮性胃炎的病例統(tǒng)計結果顯示，造模組大鼠萎縮率達到100%，腸化率達到50%，對照組大鼠未出現(xiàn)萎縮和腸化，差異有統(tǒng)計學意義。2、羔羊胃提取物維B12膠囊能夠成功逆轉大鼠慢性萎縮性胃炎：給藥后觀察發(fā)現(xiàn)，給藥組大鼠體重增量逐漸大于非給藥組，約在給藥第六周后兩組大鼠體重差異開始出現(xiàn)統(tǒng)計學意義（給藥組508.26±33.96

10、vs.非給藥組495.50±23.01，P＜0.05）。給藥組大鼠胃液 pH值略高于正常對照組大鼠，但低于非給藥組大鼠，給藥組與非給藥組相比差異有統(tǒng)計學意義（給藥組3.07±0.55 vs.非給藥組4.45±0.72，P＜0.05）。對給藥組和非給藥組大鼠病變進行定量評分統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)炎癥評分（給藥組1.43±0.53 vs.非給藥組2.14±0.69,P=0.051）無統(tǒng)計學差異，而萎縮（給藥組1.57±0.79 vs.非給藥組2.7

11、1±0.49,P=0.007）和腸化生病變（給藥組0.71±1.50 vs.非給藥組3.57±0.79,P=0.001）的評分均有統(tǒng)計學差異。給藥組大鼠胃黏膜層與黏膜肌層厚度與正常對照組大鼠較接近，非給藥組大鼠胃粘膜層厚度仍明顯減低，黏膜肌層厚度明顯增加，二者比值與給藥組相比也減小，兩組比值差異有統(tǒng)計學意義（給藥組3.78±0.45 vs.非給藥組2.37±0.38， P＜0.05）。非給藥組大鼠胃粘膜單位長度(1mm)內腺體數(shù)目均值為

12、7.47±2.06，明顯小于給藥組大鼠的9.58±1.51（P＜0.05）。統(tǒng)計胃粘膜表面增生結節(jié)數(shù)目發(fā)現(xiàn)，胃底、胃竇及全胃范圍內給藥組與非給藥組數(shù)目均有統(tǒng)計學差異（見正文第二部分圖2-3）。各組大鼠胃粘膜病變總體統(tǒng)計結果顯示，給藥組大鼠重度萎縮率和腸化率明顯小于非給藥組大鼠（重度萎縮率：給藥組14.29%vs.非給藥組71.43%， P＜0.05；腸化率：給藥組28.58%vs.非給藥組57.14%，P＜0.05）。
　　3、羔

13、羊胃提取物維B12膠囊逆轉慢性萎縮性胃炎病變涉及的潛在機制：Ki-67組化染色顯示，給藥組病變處增殖活力增高，活力與正常組相當，未給藥組的相同組織部位增殖活力低于給藥組，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)給藥組與非給藥組無統(tǒng)計學差異。Bax組化染色顯示，給藥組病變處細胞凋亡減輕，未給藥組的相同組織部位凋亡染色結果強于給藥組，提示羔羊胃藥物可能抑制胃組織細胞的凋亡，從而避免萎縮加重。比較各組大鼠血清氧化應激因子水平發(fā)現(xiàn)，給藥后，給藥組大鼠的血清SOD水平和GSH-

14、Px水平明顯升高，MDA水平則顯著下降，與正常組大鼠血清相應因子水平差距減小，與非給藥組相比，差異有統(tǒng)計學意義（具體統(tǒng)計結果見正文第二部分表2-7、表2-8和表2-9）。
　　結論：
　　1、利用Wistar大鼠給予其100μg/ml的MNNG溶液自由飲用,0.03%的雷尼替丁飼料作為食物，每周空腹灌胃1次50%酒精及饑飽失常的刺激方法，歷時20周，可以成功建立大鼠慢性萎縮性胃炎的病變模型，并且成功率高，模型穩(wěn)定性好。