使用原基分布圖技術研究觀察異氟烷對新生小鼠的神經毒性.pdf

1、大量研究證實，麻醉藥物于發(fā)育期的動物具有神經毒性作用。但在其導致神經毒性的過程中，哪些細胞死亡或者得以幸存，目前尚不明確。本實驗使用基因標記的原基分布圖（fate-map）來標記發(fā)育中或是成年小鼠的大腦內的新生細胞，以此來識別對麻醉藥物致神經毒性敏感的細胞種類。
　　本實驗選用Gli-CreERT2種系的小鼠，Gli是啟動子，用他莫昔芬可以誘導Cre重組酶的表達。Gli種系小鼠與綠色熒光蛋白(GFP)報告基因小鼠雜交獲得的雙轉基因

2、下代被用于本實驗。Gli-CreERT2∷GFP雙轉基因小鼠出生后7天，給予皮下注射250mg/kg他莫昔芬激活Cre重組酶，切除GFP基因兩端的終止密碼子，海馬區(qū)域內表達Gli的顆粒細胞祖細胞及其后代細胞自此將持續(xù)表達綠色熒光蛋白，借此可觀察GFP表達細胞來評估神經元的生存情況和形態(tài)學改變。為觀察異氟烷對新生小鼠發(fā)育中的大腦的影響，本實驗分為兩個部分:
　　(1)異氟烷對小鼠發(fā)育中大腦的短期影響
　　本部分實驗的目的是觀察

3、新生小鼠在接受異氟烷麻醉后神經細胞凋亡的情況。皮下注射他莫西芬兩周后，即小鼠出生后21天(P21)，小鼠被隨機分為對照組（吸入空氣6小時）或麻醉組（吸入1.5％異氟烷6小時）。立即給予腹腔注射氯胺酮+乙酰丙嗪+甲苯噻嗪混合溶液，經心臟灌注肝素化PBS溶液，再灌注甲醛溶液、取腦，并在甲醛溶液內固定、冷凍。冰凍切片成60μm的組織薄片，用GFP和Caspase-3（用來標記細胞凋亡）免疫熒光染色。利用共聚焦顯微鏡分別對齒狀回上支中部和下支中

4、部分層掃描。用Neurolucida軟件導入分層圖像，對表達GFP和/或Caspase-3的細胞進行計數(shù)。同時觀察同時表達GFP+caspase-3細胞的形態(tài)。由不知分組情況的觀察者進行細胞計數(shù)和細胞形態(tài)評估。
　　與對照組相比，麻醉組GFP細胞的數(shù)量和分布位置差異無統(tǒng)計學意義，caspase-3表達細胞密度顯著增加（上支:對照組:22071±6547/mm3，麻醉組:119220±14566/mm3，P＜0.001;下支:麻醉組

5、:對照組:47283±7870/mm3，209634±15732/mm3，P＜0.001）;GFP細胞中同時表達Caspase-3的細胞比例增加(上支:對照組0.9％，麻醉組22.9％，P＜0.001;下支:對照組2.7％，麻醉組27.7％，P＜0.001P＜0.001)，且形態(tài)發(fā)生退變變性，主要表現(xiàn)為樹突抽回和卷邊。
　　(2)異氟烷對于新生小鼠大腦的長期影響
　　本部分實驗的目的是觀察新生小鼠在接受異氟烷麻醉后神經細胞凋

6、亡是否長期存在。皮下注射他莫西芬兩周后，小鼠P21天時，小鼠被隨機分為對照組（吸入空氣6小時）或麻醉組（吸入1.5％異氟烷6小時），結束后待麻醉組小鼠清醒后，與對照組小鼠一起，放回其各自母鼠籠內，P28天予以斷奶、分籠。小鼠P81天，給予腹腔注射氯胺酮+乙酰丙嗪+甲苯噻嗪混合溶液，經心臟灌注肝素化的PBS溶液，再灌注甲醛溶液、取腦，并在甲醛溶液內固定、冷凍。冰凍切片成60μm的組織薄片，用GFP和Caspase-3、或GFP、Calre

7、tinin和Ki-67染色。利用共聚焦顯微鏡對齒狀回嵴部上支中部和下支中部逐層分層掃描。用Neurolucida軟件導入分層圖像，分別對表達GFP、Caspase-3、Calretinin（標記未成熟的顆粒細胞）、Ki-67（標記細胞增殖狀態(tài)）的細胞，同時表達GFP+Calretinin或GFP+Ki-67的細胞，在齒狀回門區(qū)和分子層的異位GFP標記細胞進行計數(shù)。由不知分組情況的觀察者來進行細胞計數(shù)。
　　本實驗的第一部分，麻醉導

8、致22.9-27.7％的GFP標記細胞凋亡，若這些凋亡的GFP細胞在60天內未恢復，則本部分實驗中也應觀察到與對照組相比，麻醉組的GFP標記細胞數(shù)量大約要少22.9-27.7％。而實際上，對照組和麻醉組的GFP標記細胞的數(shù)量和分布位置差異無統(tǒng)計學意義。提示在麻醉后60天內，神經細胞可能通過存活的神經祖細胞增加細胞增殖得到恢復。同時，與對照組一樣，麻醉組幾乎未見到Caspase-3表達細胞，提示異氟烷麻醉后顆粒細胞不會持續(xù)大量凋亡。與對照

9、組相比，麻醉組GFP標記細胞中表達Calretinin的細胞比例和表達Ki-67的細胞比例的差異無統(tǒng)計學意義，提示在麻醉后60天內，恢復過程已經完成。在齒狀回門區(qū)和顆粒細胞分子層的異位GFP表達細胞在兩組間的差異也無統(tǒng)計學意義，提示麻醉后的神經元細胞遵循正常模式遷移。
　　本實驗使用細胞標記技術來標記齒狀回顆粒細胞，提示兩周左右的神經元細胞對于異氟烷的神經毒性非常敏感。同時表明異氟烷對神經系統(tǒng)的損傷可隨時間恢復。這種原基分布圖技術