山慈菇多糖的提取及其對荷瘤小鼠(H22)體內和體外的作用機制的初步研究.pdf

1、惡性腹水是晚期或復發(fā)惡性腫瘤的一種非常嚴重和棘手的并發(fā)癥，而臨床上對其治療，多為穿刺或者靜脈分流術，但是這些治療方法并不能解決根本問題。山慈菇，一種蘭科植物的假鱗莖，在中醫(yī)治療中常常與其它藥物配伍使用，廣泛應用于抗炎和抗腫瘤，但其治療惡性腹水的效果尚不清楚。
　　目的：(1)從山慈菇中提取山慈菇多糖，并對其進行濃度測定，單糖組成，二級結構以及相對分子質量的測定。(2)建立小鼠H22肝癌細胞腹水模型，探究山慈菇多糖在小鼠體內對于惡性

2、腹水的作用以及對其免疫機制的研究。(3)在體外用山慈菇多糖直接作用于H22肝癌細胞，并對其抗腫瘤作用的機制進行初步探究
　　方法：①利用水提醇沉法提取山慈菇多糖，用三氯乙酸除去蛋白，有機試劑洗滌，透析等方法純化多糖。采用苯酚-硫酸法測得提取多糖的濃度，用電感耦合等離子體質譜進行單糖分析，用凝膠滲透色譜法分析多糖的相對分子質量，并用氣相色譜對該多糖的二級結構進行預測。②用H22肝癌細胞在Balb/c小鼠體內建立腹水模型，將不同濃度的

3、山慈菇多糖用腹腔注射法隔天給藥給予治療，并采用同樣的方法用環(huán)磷酰胺做陽性對照，生理鹽水做陰性對照，七次治療后觀察小鼠的腹圍，體重和生存期。在第18天后隨機處死一半小鼠，提取脾淋巴細胞，采用淋巴細胞轉化實驗測定T和B淋巴細胞的增殖指數;采用E-rose實驗檢測T細胞的免疫功能狀態(tài);并用特異性抗體標記CD8+和NK細胞，用流式細胞儀分析各組治療后CD8+和NK細胞的比例;分選小鼠脾淋巴細胞的CD4+CD25+，提取其mRNA，在mRNA水平

4、上檢測Foxp3基因的表達。用免疫組化法在小鼠的腹水細胞中分析Foxp3和Stat3的表達。用ELISA法測定小鼠血清和腹水中相關免疫因子的變化。并且用ELISA法測量小鼠血清內的甘露糖和葡萄糖的濃度水平。③在體外，用CCK8(Cell Counting Kit-8)法測山慈菇多糖對H22小鼠肝癌細胞及鼠的正常肝上皮細胞BRL-3A細胞的增殖抑制率;并用同樣的方法排除甘露糖和葡萄糖對H22細胞的影響;采用Hoechest33258和Tu

5、nel法檢測H22細胞凋亡情況，并用Western-blot法，ELISA法檢測相關蛋白表達情況，探究山慈菇多糖體外抑制H22細胞的潛在機制。
　　結果：經過提取和純化的山慈菇多糖，測得其最后的濃度為30mg/mL，對其進行分析，發(fā)現山慈菇多糖里含有60％的甘露糖，37％的葡萄糖，還有少量的半乳糖，巖藻糖，木糖，鼠李糖。其重均相對分子質量為383569kDa。山慈菇多糖的二級結構在180-260nm處，主要是反平行和無規(guī)卷曲，然后

6、是β-轉角和平行螺旋。②在小鼠移植瘤H22惡性腹水模型中，我們發(fā)現與對照組相比，山慈菇多糖治療組的小鼠的腹圍和體重明顯減少，而生存率和存活時間明顯增加了。提取小鼠的脾淋巴細胞，在脾淋巴細胞增殖的實驗和E花環(huán)實驗中，結果發(fā)現小鼠脾淋巴細胞的刺激指數和花環(huán)形成率隨山慈菇多糖濃度的增加而增長。除此之外，山慈菇多糖提高了小鼠脾淋巴細胞內的CD8+T淋巴細胞和NK細胞的比例。同時，山慈菇多糖治療組小鼠的脾淋巴細胞比對照組小鼠的Foxp3表達減少。

7、利用免疫細胞化學技術，山慈菇多糖組的小鼠腹水淋巴細胞對比對照組，Foxp3和Stat3表達隨著山慈菇濃度的升高而減少。而且，山慈菇多糖小鼠血清內的細胞因子IL-2，TNF-α，IFN-γ隨著濃度的增加而分泌增多，VEGF則分泌減少。而山慈菇多糖治療組小鼠血清內的甘露糖和葡萄糖的含量遠遠小于對照組。③體外結果顯示，山慈菇多糖對H22腫瘤細胞有一定的抑制作用，并表現出時間和濃度依賴性，48h多糖濃度為4mg/mL時的抑制率達到50％。同時，

8、山慈菇多糖在同等濃度下，對小鼠正常肝上皮細胞BRL-3A無影響。而且在甘露糖和葡萄糖的排除實驗中，發(fā)現甘露糖和葡萄糖的混合糖溶液在24小時的低濃度下，對H22細胞有很小的促進作用，但在高濃度(4mg/mL)下，在48小時后，該混合糖溶液對H22細胞有抑制作用，但最大抑制率不超過16％，比山慈菇多糖對H22細胞的影響要小得多。經Hoechest33258染色實驗和Tunel染色檢測細胞凋亡及其半定量分析，結果發(fā)現，山慈菇多糖能夠誘導H22

9、細胞凋亡，且其凋亡程度呈現出時間及濃度的依賴關系;ELISA法檢測細胞凋亡蛋白結果表示山慈菇多糖顯著誘導了H22細胞的Caspase-3和Caspas-8激活;Western-blot結果顯示：山慈菇多糖治療組比對照組的Jak1、Stat3和Bcl-2蛋白質表達水平顯著減少，而Bax的表達增加。定量分析表明，山慈菇多糖顯著抑制了Jak1-Stat3途徑，并提高了Bax/Bcl-2的比例。
　　結論：1、山慈菇多糖是一個不均一性多糖

10、，它的主要成分為甘露糖和葡萄糖，還有少量的其它益生糖，其相對分子質量為383.569kDa，二級結構主要是在180-260nm的反平行和無規(guī)卷曲，然后是β-轉角和平行螺旋。2、山慈菇多糖可以顯著的減少和延緩小鼠惡性腹水的生成，顯著延長惡性腹水小鼠的生命。3、山慈菇多糖能夠刺激T細胞和B細胞的生長，增加CD8+和NK淋巴細胞的比例，促進分泌IL-2，IFN-γ和TNF-α，減少VEGF的表達。此外，PRP可以減少小鼠體內的Foxp3和St