電針通過PI3K-AKT信號通路促進MCAO-R大鼠腦內血管再生的實驗研究.pdf

1、目的：
　　1.觀察電針對MCAO/R大鼠神經功能恢復的影響；
　　2.探討電針對MCAO/R大鼠骨髓及外周血 CD34+EPCs數(shù)量的影響；
　　3.探討電針對MCAO/R大鼠骨髓p-AKT蛋白表達的影響；
　　4.探討電針對MCAO/R大鼠大腦皮質缺血區(qū) p-AKT、eNOS、MMP-9表達的影響；
　　5.探討電針對MCAO/R大鼠大腦皮質區(qū)缺血微血管密度、腦梗死體積的影響；
　　6.探討電針能

2、否通過PI3K/AKT信號通路促進骨髓EPCs動員至外周血，參與MCAO/R大鼠大腦皮質缺血區(qū)血管再生。
　　方法：
　　采用改良線栓法制備雄性SD大鼠局灶腦缺血/再灌注（MCAO/R）模型，120只SD SPF級雄性大鼠隨機分為四組：假手術組（Sham組）、模型組（I/R組）、模型+電針組（I/RE組）、模型+電針+LY294002組（I/REL組）。局灶腦缺血90min后，根據(jù)再灌注時間點的不同，將除Sham組以外的各組

3、分為24h、48h、7d三個亞組。取大鼠“百會”穴（GV20）及左側“四關”穴為電針穴位，于再灌注一小時后進行電針刺激，每次20分鐘，每日1次，最長時間為7d。采用Zea-Longa5分法進行神經功能缺損評分，采用流式細胞術檢測骨髓、外周血CD34+EPCs的數(shù)量變化，采用Western Blot檢測骨髓p-AKT蛋白表達情況，采用Western Blot檢測大腦皮質缺血區(qū)p-AKT蛋白表達情況，采用免疫組化檢測大腦皮質缺血區(qū)eNOS、

4、MMP-9蛋白、CD34+微血管密度（Microvessel density，MVD）表達規(guī)律，采用熒光定量PCR檢測大腦皮質缺血區(qū)eNOS mRNA表達情況；TTC染色觀察局灶腦缺血灌注后第7d各組別腦梗死體積。
　　結果：
　　1.各組大鼠神經功能缺損評分
　　除Sham組無神經功能缺損癥狀。其余各組大鼠行MCAO/R術后，均呈現(xiàn)出不同程度的神經功能缺損癥狀。I/RE組再灌注24h、48h及7d，神經功能缺損癥狀逐

5、漸改善，與I/R組相比，于再灌注后第7d神經功能缺損評分顯著降低（P＜0.05）。在PI3K特異性拮抗劑LY-294002干預下，電針刺激未能顯著改善再灌注損傷大鼠的神經功能（P＞0.05）。
　　2.電針對MCAO/R大鼠骨髓CD34+EPCs數(shù)量的影響
　　大鼠局灶腦缺血/再灌注后24h、48h，I/R組骨髓CD34+EPCs數(shù)量較Sham組明顯升高（P＜0.01），且于24h達到高峰，7d時I/R組骨髓CD34+EPC

6、s數(shù)量略高于Sham組，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。電針刺激后，骨髓 CD34+EPCs于再灌注后各時間點較 I/R組明顯升高（P＜0.05），后隨再灌注時間延長而逐漸降低。阻斷PI3K作用后，電針刺激未能顯著上調骨髓CD34+EPCs數(shù)量，I/REL組CD34+EPCs數(shù)量較I/RE組顯著降低（P＜0.05）。
　　3.電針對MCAO/R大鼠外周血CD34+EPCs數(shù)量的影響
　　再灌注后24h、48h，I/R組CD3

7、4+EPCs數(shù)量較Sham組顯著增多（P＜0.01），7d時降至Sham組水平。I/RE組CD34+EPCs數(shù)量在再灌注后各時間點較I/R組增多更為顯著（P＜0.05）。腹腔注射LY-294002干預后，I/REL組的CD34+EPCs數(shù)量較I/RE組顯著降低（P＜0.05）。
　　4.電針對MCAO/R大鼠骨髓p-AKT蛋白表達影響
　　Sham組p-AKT表達較少。I/R組 p-AKT蛋白隨再灌注時間延長而逐漸增多，且明

8、顯高于Sham組（P＜0.01）。I/RE組p-AKT表達較I/R組明顯增高（P＜0.05）。在PI3K特異性拮抗劑LY294002作用下，電針刺激未能有效提高 p-AKT表達，I/REL組 p-AKT表達明顯低于I/RE組（P＜0.05）。
　　5.電針對MCAO/R大鼠大腦皮質缺血區(qū)p-AKT表達的影響
　　Sham組p-AKT蛋白表達較少，I/R組大腦皮質缺血區(qū)p-AKT蛋白表達隨再灌注時間延長而逐漸升高，且明顯高于S

9、ham組（P＜0.01）， I/RE組各時間點p-AKT表達較I/R明顯增高（P＜0.05）。LY294002阻斷PI3K作用后下，電針刺激未能有效提高p-AKT表達，I/REL組p-AKT表達低于I/RE組（P＜0.05）。
　　6.電針對MCAO/R大鼠大腦缺血皮質區(qū)eNOS蛋白和mRNA表達的影響
　　I/R和I/RE組再灌注后各時間點eNOS表達均顯著高于Sham組（P＜0.01），I/RE組各時間點eNOS的表達較

10、I/R組增多（P＜0.05）。使用LY294002阻斷PI3K作用后，I/REL組eNOS表達較I/RE組降低（P＜0.05）。
　　7.電針對MCAO/R大鼠大腦缺血皮質區(qū)MMP-9蛋白表達的影響
　　Sham組大腦皮質MMP-9表達很少。與Sham組相比，I/R組MMP-9表達于再灌注后24h開始增加（P＜0.05），48h時達到高峰（P＜0.01），7d時開始下降（P＜0.01）。再灌注后24h、48h，I/RE組MM

11、P-9表達較I/R組明顯降低（P＜0.05），7d時I/RE組多于I/R組（P＜0.05）。在LY-294002作用下，I/REL組再灌注后各時間點MMP-9表達接近I/RE組水平（P＞0.05）。
　　8.電針對MCAO/R大鼠大腦缺血皮質區(qū)CD34+MVD影響
　　大鼠行MCAO/R術后24h新生血管以單個細胞為主，管徑較小，7d MVD增多，直徑大小不等的各微血管并存。與I/R組相比，I/RE組各時間點CD34+MVD

12、顯著增多（P＜0.05），阻斷PI3K作用后，I/REL組各時間點MVD均顯著低于I/RE組（P＜0.05）。
　　9.電針對MCAO/R術后第7d各組大鼠腦梗死體積的影響
　　腦缺血/再灌注后第7d，電針治療組腦梗死體積較I/R組明顯減少（P＜0.05），LY294002特異性阻斷 PI3K作用后，電針刺激未能有效減少腦梗死體積（P＞0.05）。
　　結論：
　　1.電針治療可促進MCAO/R大鼠神經功能恢復；

13、
　　2.電針治療可促進骨髓 EPCs動員至外周血，該作用在阻斷PI3K/AKT信號轉導通路后減弱，推測電針動員骨髓EPCs入外周血與PI3K/AKT信號通路有關；
　　3.電針刺激可增加大腦缺血皮質區(qū) CD34+微血管密度，減少腦梗死體積，該作用可能與電針通過調節(jié)大腦缺血皮質區(qū)p-AKT、eNOS、MMP-9的表達有關。推測電針發(fā)揮腦缺血后的腦保護作用可能與PI3K/AKT、eNOS/MMP-9信號通路介導EPCs歸巢至腦