大鼠腦創(chuàng)傷后PI3K-Akt信號(hào)通路參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后PI3K/Akt信號(hào)通路參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,為臨床上早期干預(yù)和治療尋找新靶點(diǎn),開(kāi)拓新思路。
　　 方法:采用Marmarou方法,用重450g、直徑18mm的銅棒從1.2m高度自由落下?lián)糁写笫箢^部,造成大鼠中度彌漫性創(chuàng)傷性腦損傷。
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:SPF級(jí)健康雄性SD大鼠210只,體重280±20g,隨機(jī)分成3組:假手術(shù)組(n=42)；創(chuàng)傷+DMSO對(duì)照組(n=84)；創(chuàng)傷

2、+LY294002干預(yù)組(n=84)。每組劃分為傷后1h、3h、6h、24h、48h、72h、168h共7個(gè)時(shí)相點(diǎn)。
　　 檢測(cè)指標(biāo)及方法:①神經(jīng)功能損害評(píng)分；②HE染色鏡下觀察腦組織結(jié)構(gòu)及病理形態(tài)；③免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)p-Akt、NF-kB、Bax的免疫反應(yīng)性及組織細(xì)胞定位情況；④Western-blot法檢測(cè)p-Akt、NF-kB、Bax的蛋白表達(dá)量。
　　 另取30只大鼠經(jīng)過(guò)游泳訓(xùn)練后,隨機(jī)分為假手術(shù)組,創(chuàng)傷+D

3、MSO對(duì)照組,創(chuàng)傷+LY294002干預(yù)組,每組10只,進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試檢測(cè)大鼠傷后學(xué)習(xí)記憶功能。
　　 定量測(cè)定:免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性度強(qiáng)弱用Image Proplus6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)定量分析測(cè)定,以積分光密度值(IOD/AREA)來(lái)表示；Western blot蛋白定量分析用Image J圖像處理軟件分析測(cè)定,以目標(biāo)OD值與內(nèi)參OD值的比值來(lái)表示。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)均用(x)±s表

4、示,用SAS V8統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,以單側(cè)p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1生命體征變化大鼠打擊傷后均有尿失禁及肢體肌張力增高表現(xiàn)。60％傷后伴有一側(cè)或雙側(cè)瞳孔擴(kuò)大,持續(xù)2—5分鐘恢復(fù),50％存在后肢劇烈抽搐,40％存在輕度抽搐、擺尾,持續(xù)0.5-1分鐘。致傷后多數(shù)呈短暫去大腦狀態(tài)及呼吸抑制,無(wú)輔助呼吸條件下,致傷后1-4分鐘恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)大鼠死亡率為8％。
　　 2形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

5、 HE染色光鏡結(jié)果顯示:假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常,無(wú)蛛網(wǎng)膜下腔出血及腦室出血,血管管腔正常,管壁光滑,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量多,形態(tài)完整。創(chuàng)傷組大鼠腦組織可見(jiàn)不同程度的廣泛蛛網(wǎng)膜下腔出血或黃染,血管腔擴(kuò)大,大腦皮層下廣泛組織水腫,毛細(xì)血管充血,血管壁增厚,血管腔塌陷,神經(jīng)細(xì)胞變性,大腦皮層與深部白質(zhì)交界區(qū)間隙增寬,組織間質(zhì)水腫、出血等改變。未見(jiàn)腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血及挫裂傷。LY294002干預(yù)組腦組織病理形態(tài)改變較DMSO對(duì)照組有不同程度加重(Fig.

6、6)。
　　 3神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分為24分。與假手術(shù)組比較,創(chuàng)傷組大鼠在后肢抓持反射、觸須誘發(fā)前肢定位及側(cè)向墊步試驗(yàn)中均表現(xiàn)異常,評(píng)分下降(p<0.05)。IN294002干預(yù)組與DMSO對(duì)照組比較,在48h、72h、168h神經(jīng)功能評(píng)分下降(p<0.05)(Fig.4-1,2；Tablel)。
　　 4 p-Akt免疫組化及Western blot檢測(cè)結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示:p-Akt陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)不

7、規(guī)則,胞核固縮,陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒,主要定位于胞漿,少部分定位于胞核。假手術(shù)組偶見(jiàn)p-Akt陽(yáng)性細(xì)胞,著色淺淡,免疫反應(yīng)性不隨時(shí)間發(fā)生變化。在DMSO對(duì)照組p-Akt陽(yáng)性細(xì)胞著色呈深棕黃色,在傷后6h表達(dá)顯著增加,隨時(shí)間推移陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多,免疫反應(yīng)性逐漸增強(qiáng),24h表達(dá)達(dá)高峰,之后表達(dá)逐漸衰減,陽(yáng)性產(chǎn)物持續(xù)表達(dá)至傷后168h仍高于假手術(shù)組。在LY294002干預(yù)組,p-Akt的表達(dá)時(shí)程與DMSO對(duì)照組相似,但各時(shí)相點(diǎn)免疫反應(yīng)性明顯減

8、弱(p<0.05)。Westernblot檢測(cè)結(jié)果同免疫組化結(jié)果(Fig.1-1,2,3,4；Fig.7-1,2；Table3—1,2)。
　　 5.NF-kB免疫組化及Western blot檢測(cè)結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示:NF-kB陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)和/或胞核中彌漫棕黃色顆粒。假手術(shù)組NF-kB陽(yáng)性產(chǎn)物微弱表達(dá),細(xì)胞胞漿可見(jiàn)少量棕黃色顆粒,此時(shí)NF-kB以無(wú)活性的形式存在。DMSO對(duì)照組于傷后3h在胞漿和胞核即有陽(yáng)性表達(dá),此時(shí)出現(xiàn)明顯

9、NF-kB核轉(zhuǎn)位,并且陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)隨時(shí)間呈上升趨勢(shì),免疫反應(yīng)性在24-48h達(dá)高峰,此時(shí)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均可見(jiàn)到大量棕黃色顆粒,之后表達(dá)逐漸衰減,至傷后168h仍有表達(dá)且高于假手術(shù)組。LY294002干預(yù)組中,各時(shí)相點(diǎn)NF-kB的陽(yáng)性表達(dá)均較DMSO對(duì)照組明顯減弱(p<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:傷后1-168h,DMSO對(duì)照組及LY294002干預(yù)組中NF-kB的陽(yáng)性表達(dá)高于假手術(shù)組(p<0.05),傷后3h胞漿

10、陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)明顯增強(qiáng),在6h達(dá)高峰,之后開(kāi)始下降,至168h陽(yáng)性表達(dá)仍高于假手術(shù)組水平。此結(jié)果與免疫組化結(jié)果不符,我們認(rèn)為出現(xiàn)此情況的因?yàn)槭荖F-kB在傷后3h出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位,在24-48h核轉(zhuǎn)位達(dá)高峰。傷后1h至168h,LY294002干預(yù)組中胞漿NF-kB陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)低于DMSO對(duì)照組(p<0.05)(Fig.2-1,2,3,4；Fig.8-1,2；Table4—1,2)。
　　 6 Bax免疫組化及Weaern blot檢

11、測(cè)結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示:Bax陽(yáng)性產(chǎn)物定位于胞漿,呈彌漫或散在的棕黃色顆粒。假手術(shù)組中Bax在大鼠腦皮質(zhì)極少量表達(dá),且不隨時(shí)間變化。DMSO對(duì)照組中傷后6h Bax陽(yáng)性細(xì)胞呈深棕黃色,陽(yáng)性產(chǎn)物明顯增多,免疫反應(yīng)性于48h-72h達(dá)高峰,168h表達(dá)下降但仍高于假手術(shù)組水平。LY294002干預(yù)組中Bax在傷后各時(shí)相點(diǎn)的表達(dá)較DMSO對(duì)照組增強(qiáng)(p<0.05)。Weaern blot檢測(cè)結(jié)果同免疫組化結(jié)果(Fig.3—1,2,3,4；Fi

12、g.9-1,2；Table5—1,2)
　　 7 Morris水迷宮結(jié)果創(chuàng)傷組大鼠在傷后第7-10天搜索安全島潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)(p<0.05)。LX294002干預(yù)組大鼠在傷后第7—10天搜索安全島潛伏期較DMSO對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(p<0.05)。另外運(yùn)動(dòng)軌跡圖象分析顯示DMSO對(duì)照組大鼠在搜索策略上也較LY294002干預(yù)組更為理想(Fig.5-1,2；Fig.10-1,2,3；Table2)。
　　 結(jié)論: