Epac分子對鼠GH3細胞系細胞增殖和生長激素合成分泌及其與細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路相互作用的研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分進行探討：
　　第一部分 cAMP誘導的垂體腺瘤 GH3細胞增殖與其下游效應(yīng)分子PKA和Epac的關(guān)系及Epac對GH3細胞增殖的影響
　　目的：驗證cAMP激活對大鼠垂體腺瘤GH3細胞增殖的影響，探究其下游效應(yīng)分子PKA和Epac在其中發(fā)揮的作用，證實Epac與GH3細胞系增殖之間的關(guān)系
　　方法：首先采用CCK8法，研究 cAMP激活劑Forskolin及PKA和Epac的抑制劑對 GH3細胞增

2、殖的作用。然后以 Epac特異性激活劑8-pCPT-2’-O-Me-cAMP作用于GH3細胞，分別采用CCK8法和EDU法在細胞水平和DNA水平上證實Epac激活對GH3細胞增殖的影響。
　　結(jié)果：Forskolin激活cAMP后可以明顯促進GH3細胞的增殖，PKA和Epac抑制劑可以分別部分抑制這種促增殖效應(yīng)，但抑制以后的GH3細胞增殖仍具有統(tǒng)計學差異。8-pCPT-2’-O-Me-cAMP特異性激活 Epac對 GH3細胞產(chǎn)生

3、促增殖作用，且呈濃度依賴效應(yīng)。
　　結(jié)論：cAMP激活對GH3細胞產(chǎn)生的促增殖作用可分別通過其下游效應(yīng)分子PKA和Epac來實現(xiàn)。單獨特異性激活Epac亦可促進GH3細胞增殖。
　　第二部分 Epac激活促進 GH3細胞系 MAPK信號通路磷酸化ERK1/2表達增加但對 CREB磷酸化無影響
　　目的：研究cAMP激活后對GH3細胞內(nèi)ERK1/2和CREB的影響及其與Epac的關(guān)系，探索cAMP-Epac激活后的下游信

4、號傳導通路
　　方法：首先分別用PKA和Epac抑制劑作用于GH3細胞后，Western blotting檢測Forskolin激活cAMP后對GH3細胞p-ERK1/2和p-CREB表達的影響。然后以Epac激活劑和抑制劑，或SiRNA干預(yù)細胞，以及B-Raf抑制劑作用于GH3細胞，Western blotting檢測其p-ERK1/2表達的變化。
　　結(jié)果：cAMP激活后明顯促進GH3細胞p-ERK1/2表達，這種促進作

5、用可分別被PKA和EPAC抑制劑部分抑制。CAMP激活后明顯促進GH3細胞p-CREB表達，這種促進作用只能被PKA抑制劑抑制，但不能被Epac抑制劑抑制。Epac特異性激活亦可促進GH3細胞p-ERK1/2表達，藥物阻斷B-Raf可以抑制這種作用。
　　結(jié)論：GH3細胞中，cAMP激活后與MAPK/ERK產(chǎn)生交叉通訊，并促進p-ERK1/2表達增加，這種效應(yīng)可被PKA和Epac分別介導。cAMP激活對p-CREB促表達作用的影響

6、與Epac無關(guān)。cAMP-Epac與MAPK/ERK產(chǎn)生的交叉通訊需要B-Raf的參與。
　　第三部分 Epac激活對 GH3細胞的促增殖作用與 B-Raf及MAPK/ERK信號通路的關(guān)系
　　目的：研究Epac激活后對GH3細胞的促增殖作用與MAPK/ERK信號通路的關(guān)系及B-Raf在其中發(fā)揮的作用
　　方法：使用MAPK/ERK和B-Raf的抑制劑干預(yù)GH3細胞，再以Epac特異性激活劑處理細胞，CCK8法檢測 G

7、H3細胞增殖水平的變化。Western blotting檢測細胞周期蛋白cyclin D3的表達水平改變。
　　結(jié)果：細胞水平上， Epac激活對 GH3細胞產(chǎn)生的促增殖作用可以被MAPK/ERK和B-Raf的抑制劑完全抑制。在蛋白水平上，Epac激活促進GH3細胞cyclin D3的表達增加效應(yīng)也被MAPK/ERK和B-Raf的抑制劑。
　　結(jié)論：Epac激活后對GH3細胞的促增殖作用是通過MAPK/ERK的激活來實現(xiàn)的，

8、B-Raf也在其中發(fā)揮了介導作用。
　　第四部分 Epac激活對GH3細胞生長激素合成和分泌的作用
　　目的：研究特異性激活Epac后對GH3細胞生長激素合成和分泌的作用。
　　方法：特異性Epac激活劑作用于GH3細胞特定時間，然后以Real-time PCR檢測生長激素mRNA表達變化。用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Elisa）方法檢測GH3細胞胞內(nèi)和培養(yǎng)基中生長激素的水平。
　　結(jié)果：Epac激活后，對GH3細胞生長