家蠶p53和mdm2同源基因的克隆與功能的初步分析.pdf

1、P53是迄今與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，最初在研究SV40病毒的癌蛋白時(shí)被發(fā)現(xiàn)。隨著對(duì)P53研究的逐漸深入，人們認(rèn)識(shí)到突變型P53具有促進(jìn)腫瘤作用，而野生型P53則具有抑癌功能。P53是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它主要通過(guò)與下游靶基因結(jié)合，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞周期和腫瘤發(fā)生等過(guò)程中發(fā)揮舉足輕重的調(diào)控作用。MDM2作為P53最重要的伴侶蛋白，通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制相互制約，從而使它們各自在正常細(xì)胞中的表達(dá)維持在一個(gè)較低的平衡水平。

2、r>　　 利用人、小鼠和果蠅的p53基因作為電子探針在GenBank家蠶(Bombyx mori)EST數(shù)據(jù)庫(kù)中找到p53同源序列，通過(guò)NCBI BLAST檢索到4條已公布的家蠶BmP53基因序列。為進(jìn)一步證實(shí)家蠶中p53同源基因的存在，根據(jù)已登錄的序列設(shè)計(jì)特異引物，分別在家蠶蛹和家蠶BmN細(xì)胞中均擴(kuò)增到條帶單一的片段。通過(guò)生物信息學(xué)分析，顯示該序列的全長(zhǎng)為737 bp，是一條編碼框?yàn)?23 bp，含有5個(gè)外顯子的家蠶p53同源基因，

3、命名為BmP53-240;對(duì)BmP53-240氨基酸序列分析，結(jié)果表明BmP53-240同已公布的4條家蠶BmP53的氨基酸序列之間具有較高的同源性，它們都具有一個(gè)類似的核心結(jié)構(gòu)，但在此結(jié)構(gòu)的上下游則存在差異;對(duì)BmP53蛋白結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)BmP53-240具有P53的典型結(jié)構(gòu)域，推測(cè)BmP53-240可能為家蠶P53蛋白異構(gòu)體之一;利用帶有egfp的重組桿狀病毒vBm-Pph-BmP53-240感染家蠶BmN細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)熒光集中在細(xì)胞

4、邊緣且強(qiáng)度弱于vBm-Pph-eGFP，推測(cè)BmP53-240定位于細(xì)胞質(zhì)中，可能對(duì)細(xì)胞活性具有調(diào)節(jié)作用。
　　 為研究BmP53-240的相關(guān)功能，利用家蠶核型多角體病毒(BmNPV)作為對(duì)照，重組桿狀病毒vBm-ie1-BmP53-240分別感染BmN細(xì)胞。Giemsa染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，感染后的BmN細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡形態(tài)，推測(cè)BmP53-240可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡過(guò)程;而JC-1染色結(jié)果顯示，感染病毒的BmN細(xì)胞的線粒體膜電位

5、的變化與對(duì)照組沒(méi)有明顯的差異，推測(cè)BmP53-240可能不介導(dǎo)線粒體凋亡途徑。基于桿狀病毒宿主域的不同，以vBm-ie1-BmP53-240和vAc-pie1-BmP53-240分別感染Tn細(xì)胞和BmN細(xì)胞，以CCK-8試劑檢測(cè)不同感染時(shí)間的細(xì)胞活性。結(jié)果顯示隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種細(xì)胞活性均明顯下降，推測(cè)BmP53-240可能具有影響細(xì)胞增殖的功能。
　　 為明確BmP53-240與MDM2的表達(dá)關(guān)系，利用EST家蠶數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到

6、mdm2同源基因。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異引物，在家蠶蛹的cDNA中擴(kuò)增到長(zhǎng)度為885 bp的mdm2同源基因，命名為BmMDM2。生物信息學(xué)分析顯示該序列在結(jié)構(gòu)與進(jìn)化上具有保守性，推測(cè)該基因的功能可能與P53有關(guān)。設(shè)計(jì)全長(zhǎng)BmP53、BmP53-240及MDM2特異引物，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)分析三者在BmNPV感染不同時(shí)間的BmN細(xì)胞中的表達(dá)狀況。結(jié)果顯示，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)BmMDM2表達(dá)量下調(diào)，BmP53表達(dá)水平上調(diào)，而B(niǎo)m