RanGTPase激活蛋白R(shí)anGAP在嗜熱四膜蟲(chóng)細(xì)胞中的定位及功能分析.pdf

1、RanGTPase激活蛋白（RanGTPase-activating protein，RanGAP）是細(xì)胞質(zhì)中調(diào)節(jié)Ran活性的重要因子，含有保守的富含亮氨酸的LRR（leucine-rich repeats）結(jié)構(gòu)域。RanGAP可與Ran蛋白結(jié)合并促進(jìn)Ran對(duì)GTP的水解。哺乳動(dòng)物RanGAP1蛋白通過(guò)Ran通路參與了多種生命活動(dòng)，包括核質(zhì)運(yùn)輸、有絲分裂中期紡錘體的組裝、分裂后期核膜的重建；RanGAP1調(diào)節(jié)擬南芥雌性配子的發(fā)育過(guò)程中減

2、數(shù)分裂后的第二次有絲分裂的進(jìn)行；酵母RanGAP1蛋白參與了異染色體的組裝。
　　真核單細(xì)胞原生動(dòng)物嗜熱四膜蟲(chóng)（Tetrahymena thermophila）同時(shí)含有小核及大核兩個(gè)細(xì)胞核，具有有性生殖及無(wú)性生殖兩種生殖方式。對(duì)Ran蛋白通路在嗜熱四膜蟲(chóng)中功能的研究表明Ran1、RBP1及RCC1的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致大核無(wú)絲分裂的異常。目前，尚未有RanGAP在雙核纖毛蟲(chóng)細(xì)胞中的功能報(bào)道。本研究首次從嗜熱四膜蟲(chóng)大核基因組中鑒定出一個(gè)保

3、守的RanGAP基因，并對(duì)RanGAP蛋白序列、定位模式及生物功能進(jìn)行了分析，主要結(jié)果如下：
　　1. RanGAP基因的生物信息學(xué)分析 RanGAP（TTHERM_00766430）全長(zhǎng)1423bp，包含兩個(gè)內(nèi)含子，開(kāi)放閱讀框?yàn)?074 bp，預(yù)測(cè)編碼357個(gè)氨基酸，含有一個(gè)富含亮氨酸的LRRs結(jié)構(gòu)域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR表明，RanGAP在四膜蟲(chóng)生長(zhǎng)期、饑餓期和有性生殖期均有表達(dá)，且在有性生殖4~6 h表達(dá)水平最高。不同物種中的

4、RanGAP蛋白序列比對(duì)分析結(jié)果表明RanGAP蛋白進(jìn)化上具有保守的結(jié)構(gòu)域和物種特異的可變區(qū)。
　　2. HA-RanGAP在細(xì)胞內(nèi)的定位構(gòu)建含有HA-tag的pNeo4-HA-GAP載體并轉(zhuǎn)化入嗜熱四膜蟲(chóng)細(xì)胞中，利用巴龍霉素抗性篩選出HA-GAP突變嗜熱四膜蟲(chóng)株。免疫熒光定位發(fā)現(xiàn)：HA-RanGAP在嗜熱四膜蟲(chóng)的生長(zhǎng)期、饑餓期及有性生殖早期均定位于四膜蟲(chóng)的胞質(zhì)中，并在大核周圍富集；當(dāng)有性生殖進(jìn)行到“anlagen”時(shí)期及配對(duì)細(xì)胞

5、分開(kāi)后，HA-RanGAP不僅定位于胞質(zhì)中，而且在凋亡的親本大核上富集。當(dāng)配對(duì)細(xì)胞分開(kāi)后，親本大核內(nèi)的DNA進(jìn)一步凝縮，HA-RanGAP在親本大核中表現(xiàn)出不均一的定位，而且HA-RanGAP的定位與凝縮的DNA交錯(cuò)，表明HA-RanGAP定位于核質(zhì)中。HA-RanGAP的Western印跡分析顯示40 kD和48 kD的兩條特異條帶。40 kD應(yīng)為 HA-RanGAP，48 kD可能是 SUMO化修飾后的 HA-RanGAP（HA-R

6、anGAP-X）。隨著有性生殖進(jìn)程的進(jìn)行，HA-RanGAP-X的相對(duì)表達(dá)量增加暗示SUMO化修飾的RanGAP可能參與了新本大核的凋亡過(guò)程。
　　3. RanGAP異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核分裂及胞質(zhì)縊縮異常構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體pXS-RanGAP及敲除載體pNeo4-KO-RanGAP并轉(zhuǎn)化入四膜蟲(chóng)細(xì)胞，篩選得到過(guò)表達(dá)及敲除RanGAP四膜蟲(chóng)突變株。結(jié)果表明RanGAP的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致嗜熱四膜蟲(chóng)無(wú)性生殖時(shí)大核不能正常拉伸且胞質(zhì)縊縮異常，最終生

7、成無(wú)大核細(xì)胞。RanGAP基因敲減會(huì)引起大核呈現(xiàn)彌散狀或不規(guī)則形狀，大核的無(wú)絲分裂受到抑制從而生成無(wú)大核后代。
　　4. RanGAP的異常表達(dá)影響RAN、RBP1、RCC1的轉(zhuǎn)錄水平實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)或敲除RanGAP基因后，通路中的RAN1、RBP1及RCC1基因的轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的下調(diào)或者上調(diào)，表明四膜蟲(chóng)Ran信號(hào)通路中各因子在功能上存在相互調(diào)節(jié)。
　　本研究首次從嗜熱四膜蟲(chóng)中鑒定出一個(gè)RanG