含熒光素酶嗜熱四膜蟲的構建及對重金屬離子的響應.pdf

1、金屬硫蛋白(Metallothioneins，MTs)廣泛存在于各種生物體中，是一類富含半胱氨酸可被鎘、銅、鋅、鉛或汞等金屬誘導表達的低分子量蛋白，同時可作為生物標記物用于環(huán)境中重金屬污染的監(jiān)測。根據來源，金屬硫蛋白被分為15個家族，其中四膜蟲金屬硫蛋白屬于第7家族。
　　 嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)是一類纖毛類原生動物。在嗜熱四膜蟲中存在五種金屬硫蛋白基因，分別為:MTT1，MTT2，MTT3

2、，MTT4和MTT5，根據對鎘或銅的不同誘導表達響應模式等特征，四膜蟲MTs被進一步劃分為7a(CdMTs)和7b(CuMTs)兩個亞家族。為了獲得可用于快速檢測環(huán)境中重金屬污染的全細胞生物傳感器(Whole cell biosensor，WCB)，我們將MTT1基因啟動子分別與作為報告元件的螢火蟲熒光素酶基因(Firefly Luciferase，F(xiàn)luc)和海腎熒光素酶基因（RenillaLuciferase，Rluc）重組，構建嗜

3、熱四膜蟲細胞全細胞生物傳感器;此外，通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測Cr(Ⅵ)誘導五種四膜蟲MTs的轉錄情況，對四膜蟲MTs的轉錄機制進行了初步研究，獲得結果如下:
　　 1.Fluc和Rluc基因的優(yōu)化Fluc基因全長1653bp，編碼551個氨基酸，預測分子量為61kDa;而Rluc基因全長936bp，編碼311個氨基酸，預測分子量為36kDa。通過PCR技術將Fluc基因的終止密碼子TAA(在四膜蟲中編碼Gln

4、)優(yōu)化為四膜蟲中的終止密碼子TGA;通過人工合成技術將Rluc基因全序列優(yōu)化為四膜蟲的偏愛密碼子。從而獲得兩種可在四膜蟲體內穩(wěn)定表達的熒光素酶基因。
　　 2.含有熒光素酶的四膜蟲全細胞生物傳感器的構建構建重組質粒pBX-Fluc和pBX-Rluc，其中含有熒光素酶基因，MTT1基因啟動子，HA標簽，neo2抗性基因;通過基因槍粒子轟擊法將pBX-Fluc和pBX-Rluc質粒分別轉化入嗜熱四膜蟲細胞中，通過同源重組和巴龍霉素抗

5、性篩選，F(xiàn)luc和Rluc基因整合到四膜蟲大核基因組MTT1位點，獲得含有熒光素酶基因的重組四膜蟲細胞株B2086-Fluc和CU428-Rluc。
　　 3.重組四膜蟲對重金屬離子的監(jiān)測在重金屬離子誘導時B2086-Fluc和CU428-Rluc表達產生熒光素酶，催化熒光素氧化反應產生生物熒光，通過熒光測定儀測定氧化過程中釋放的生物熒光，進而通過直觀的數(shù)據來反應四膜蟲WCBs響應重金屬離子的情況。結果發(fā)現(xiàn)B2086-Fluc對

6、重金屬鎘和汞的響應最敏感，可檢測的最低濃度為5～10 ng/mL;對銅和鋅的響應較弱，可檢測的最低濃度為0.5～1 mg/mL;CU428-Rluc也對重金屬鎘和汞的響應最敏感,可檢測的最低濃度為5 ng/mL;對銅和鋅的響應較弱，可檢測的最低濃度為0.1mg/mL; Western blot檢測發(fā)現(xiàn)全序列優(yōu)化后的Rluc在重金屬離子誘導時的表達量比Fluc高，且重組四膜蟲CU428-Rluc響應重金屬的范圍更廣。
　　 4嗜熱

7、四膜蟲CdMTs和CuMTs對Cr(Ⅵ)的不同響應Cr(Ⅵ)對嗜熱四膜蟲細胞繁殖速度影響的半致死量為80μM，而Cr(Ⅲ)的半致死量為3mM。通過qRT-PCR方法檢測Cr(Ⅵ)單獨誘導和Cr(Ⅵ)與Cd(Ⅱ)/Cu(Ⅱ)雙重誘導時CdMTs和CuMTs的表達情況，結果表明Cr(Ⅵ)單獨誘導時促進CuMTs的表達，而對CdMTs的表達影響不明顯;Cr(Ⅵ)抑制Cd(Ⅱ)/Cu(Ⅱ)誘導的CdMTs的高表達，而對Cd(Ⅱ)/Cu(Ⅱ)誘導