一種短小芽孢桿菌分離鑒定及培養(yǎng)條件研究.pdf

1、隨著工業(yè)化的進(jìn)展，城市生活垃圾已經(jīng)不僅只包含有機(jī)化合物，越來(lái)越多的人工合成的化合物也被排放到環(huán)境中，有些化合物含有劇毒，有致癌的作用，而且很難自然降解。這些有害的物質(zhì)隨著垃圾滲透液，對(duì)周?chē)叵滤屯寥涝斐闪藝?yán)重的污染。治理環(huán)境污染已經(jīng)成為世界各國(guó)努力攻克的難題?？茖W(xué)家們治理環(huán)境采用的是化學(xué)、物理方法結(jié)合生物方法來(lái)處理污染物。近年來(lái)，科學(xué)家們針對(duì)不同的污染物采用不同的治理方法，其中微生物方法治理環(huán)境具有明顯的優(yōu)勢(shì)。但是由于人們?nèi)粘Ｉ钪谢?/p>

2、本上不對(duì)垃圾進(jìn)行分類(lèi)，導(dǎo)致了生活垃圾滲透液中金屬離子含量很高，一些降解垃圾的菌株抗性差，處理垃圾效果不明顯。因此亟待開(kāi)發(fā)出一種高表達(dá)的、抗性強(qiáng)的，且能夠降解垃圾滲透液污染物的優(yōu)良菌株。已經(jīng)有研究報(bào)道短小芽孢桿菌對(duì)降解垃圾有很好的效果，且短小芽孢桿菌由于繁殖速度快，能產(chǎn)生穩(wěn)定的芽孢，抗逆能力強(qiáng)，成為了越來(lái)越受矚目的生防材料之一。
　　短小芽孢桿菌的生長(zhǎng)受外部環(huán)境的影響，環(huán)境不適宜生長(zhǎng)的情況下，就會(huì)由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檠挎?，處于休眠狀態(tài)，

3、不能高效快速生長(zhǎng)。碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽都會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)。因此需要篩選出滿(mǎn)足其生長(zhǎng)的最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及最優(yōu)生長(zhǎng)條件。
　　本研究針對(duì)短小芽孢桿菌的16SrRNA基因堿基序列和gyrA、rpoA基因序列設(shè)計(jì)了6對(duì)特異性引物，通過(guò)對(duì)填埋場(chǎng)垃圾滲透液中分離得到的菌株，進(jìn)行生理實(shí)驗(yàn)和特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)來(lái)分離篩選鑒定得到短小芽孢桿菌。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了短小芽孢桿菌所需的最適培養(yǎng)基組分，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定出最適培養(yǎng)基組分的最佳配比。在最

4、適培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，優(yōu)化最佳發(fā)酵條件。得到短小芽孢桿菌生長(zhǎng)所需的最優(yōu)培養(yǎng)基及最佳發(fā)酵條件。從垃圾滲透液中分離得到的菌株細(xì)胞呈現(xiàn)桿狀，革蘭氏陽(yáng)性，通過(guò)對(duì)菌株進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)，分析電泳結(jié)果圖，確定菌株為短小芽孢桿菌。該方法可以方便、快捷地分析檢測(cè)出短小芽孢桿菌，避免了進(jìn)行16SrRNA基因序列的測(cè)序以及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析的步驟。
　　通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了短小芽孢桿菌最佳培養(yǎng)基的成分為:玉米淀粉，酵母提取物，MgSO4·

5、7H2O。利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了短小芽孢桿菌的培養(yǎng)基，得到最適培養(yǎng)基為:玉米淀粉0.1％，酵母提取物1.0％，MgSO4·7H2O0.49％，小牛浸膏0.3％，NaCl0.5％。并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)法確定了最佳培養(yǎng)條件，溫度37℃，初始pH7.2，接種量為5％。采用最優(yōu)培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10h。測(cè)得OD320值由1.44增長(zhǎng)為6.93。生長(zhǎng)量提高了將近4.8倍。
　　通過(guò)篩選得到的短小芽孢桿菌需要制成制劑大

6、量投入使用。芽孢比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞易保存，復(fù)活率高，是影響短小芽孢桿菌制劑效果的關(guān)鍵因素是芽孢的含量，因此要研究得到形成芽孢的條件。有報(bào)道培養(yǎng)基中含有錳離子對(duì)短小芽孢桿菌形成芽孢是有利的，一定濃度的錳離子可以促進(jìn)菌體和芽孢的生長(zhǎng)。所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同濃度錳離子對(duì)短小芽胞桿菌的芽胞產(chǎn)率的影響進(jìn)行了研究，以期在活菌含量高的同時(shí)獲得較高的芽胞產(chǎn)量，為短小芽孢桿菌制劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。經(jīng)研究得到在最優(yōu)培養(yǎng)基中加入0.007％的Mn2+能夠提高活菌數(shù)和芽