蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的分離鑒定及PCR診斷方法的建立.pdf

1、蜜蜂美洲幼蟲腐臭?。ˋmerican foulbrood，AFB），簡稱美幼病，是目前主要侵害蜜蜂幼蟲生長的細菌性病害之一。美幼病的病原體是幼蟲芽孢桿菌（Paenibacillus Larvae），革蘭氏染色呈陽性。該菌的芽孢具有7層結構包圍，而一般細菌的芽孢具有4~5層結構包圍。這種特殊的結構使幼蟲芽孢桿菌的芽孢生命力特別頑強，對熱刺激和化學消毒劑等都具有很強的抵抗力，在高溫、干燥等惡劣環(huán)境下仍然可以保持很強的感染性，能存活35年之久

2、。正是因為幼蟲芽孢桿菌具有這種特殊結構的芽孢可以引起美洲幼蟲腐臭病，而并非是其營養(yǎng)體的作用。在蜂群內傳播方式包括水平傳播和垂直傳播，而在群間主要是通過垂直傳播的方式。也因為傳播方式的特殊性使其成為影響蜜蜂幼蟲生長的主要疾病。該病多發(fā)生于夏、秋兩季，輕者影響蜂群的繁殖和采集力，重者造成全群或全場蜂群覆滅。目前國內外關于美幼病病原體檢測鑒定的報道還比較少，且大多集中于研究細菌分離、菌落形態(tài)觀察、顯微鏡鏡檢、生化試驗等檢測方法。然而，由于芽孢

3、在病蟲或蜂蜜樣品中的含量比較少，且有很多其他相近種類的細菌，使得分離鑒定的難度有所增加。但隨著分子生物學的發(fā)展，PCR檢測方法因其診斷快速、敏感性較高、特異性較強等特點，可用于快速應用于美洲幼蟲腐臭病的診斷，尤其可針對蜂病的混合感染和蜂產品的質量檢測更為有效。
　　近幾年來，養(yǎng)蜂業(yè)已成為吉林省延邊朝鮮族自治州的特色牧業(yè)，隨著蜜蜂養(yǎng)殖密度加大，蜜蜂各種疾病的發(fā)生也伴隨而來，影響著養(yǎng)蜂業(yè)的發(fā)展。美洲幼蟲腐臭病如今已成為嚴重威脅延邊養(yǎng)蜂

4、業(yè)發(fā)展的重要疫病之一，因此，分離幼蟲芽孢桿菌本地株、建立患病蜜蜂和蜂產品檢測方法的研究是十分必要的。
　　本試驗為了分離幼蟲芽孢桿菌延邊株，利用疑似患美幼病的病蟲通過改良胡蘿卜酵母瓊脂培養(yǎng)基的分離培養(yǎng)，成功分離出特異性菌落；并利用革蘭氏染色、孔雀石綠染色等方法鏡檢觀察、H2O2試驗、牛乳試驗等細菌的生化特性進行生化鑒定，以及 PCR分子生物學方法進行初步鑒定。結果顯示，革蘭氏染色鏡檢可見清晰的革蘭氏陽性桿形菌體。孔雀石綠染色鏡檢可

5、見菌體為紅色，芽孢為綠色。菌株在H2O2試驗反應中沒有氣泡產生，牛乳試驗結果表明加入菌體的新鮮牛奶出現凝結沉淀稍后又消失。PCR擴增顯示該菌在1.0％瓊脂糖凝膠電泳1474 bp左右有清晰條帶，以上結果初步證明所分離的菌體為幼蟲芽孢桿菌。
　　根據分離的幼蟲芽孢桿菌測序結果以及 GenBank發(fā)表的幼蟲芽孢桿菌16S rRNA基因保守區(qū)（AB073204）設計合成一對特異性引物 AFBU和 AFBL，建立本地幼蟲芽孢桿菌的PCR檢

6、測方法。結果表明，該方法可特異性擴增幼蟲芽孢桿菌16S rRNA序列上大小為1353bp的片段，對蜜蜂敗血桿菌、蜜蜂球囊菌、蜂房蜜蜂球菌的擴增結果均為陰性，具有良好的特異性；對倍比稀釋的芽孢桿菌進行檢測，其敏感性可達45CFU/mL的幼蟲芽孢桿菌。將一定量的幼蟲芽孢桿菌增添到蜂蜜、蜂膠和蜂王漿等蜂產品中進行檢測結果說明，建立的PCR檢測方法具有快速、準確、敏感、特異等優(yōu)點，完全適用于疑似患病蜜蜂和蜂產品的檢測。應用所建立的PCR檢測方法