發(fā)展面向于活細胞研究的表面增強拉曼光譜技術(shù).pdf

1、細胞是組成生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單元，一切生命現(xiàn)象都是細胞活動的體現(xiàn)。細胞的生命活動是一個時刻發(fā)生變化、同時又具有顯著空間差異的過程，其增殖、新陳代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動直接影響著人類的生長和發(fā)育，一切疾病的發(fā)生發(fā)展機制也必須以細胞病變研究為基礎(chǔ)。因此，細胞體系研究是現(xiàn)代生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的重要基礎(chǔ)。然而，由于細胞體系具有復(fù)雜性、動態(tài)性和具有生命活性等特點，發(fā)展和利用無損、可靠性好、靈敏度高的分析技術(shù)對復(fù)雜細胞體系的生命活動進行研究具有

2、十分重要的學(xué)術(shù)意義及應(yīng)用價值。
　　表面增強拉曼光譜(SERS)技術(shù)因其具有極高的檢測靈敏度、能從分子水平上獲取待測體系的本征信息，譜峰窄、適用于多組分檢測、無損且不受自發(fā)熒光和水的干擾等突出優(yōu)勢，特別適合于生物體系，尤其是活細胞體系的研究。目前，SERS作為一種新興光譜技術(shù)已經(jīng)在生物分子、病毒、細菌、細胞、組織甚至活體等生物體系的研究中都發(fā)揮了重要作用。SERS應(yīng)用于細胞體系研究的基本方法主要有直接檢測和間接檢測兩類。直接檢測法

3、充分發(fā)揮了SERS技術(shù)能獲得細胞體系本征信息的優(yōu)勢，但細胞體系的SERS光譜信息通常十分復(fù)雜，需要各種生物分子的標(biāo)準(zhǔn)SERS光譜作為參考對其進行可靠歸屬和分析;然而，由于大部分生物分子的拉曼散射截面較小且與納米結(jié)構(gòu)的作用較弱，目前獲得生物分子的高靈敏、可靠SERS光譜仍然存在挑戰(zhàn)。由于細胞內(nèi)含有大量生物分子，因此利用SERS直接檢測方法可以獲得細胞自身組分的本征光譜信息。但對于細胞內(nèi)的一些重要參數(shù)，如pH和溫度等，沒有能直接提供該參數(shù)特

4、征的細胞內(nèi)物質(zhì)，因此需要借助外來探針作為指示，繼而利用SERS間接檢測方法對這些細胞的重要參數(shù)進行傳感。間接檢測法利用有標(biāo)記分子修飾的SERS探針強信號和多功能的優(yōu)勢，特別適合于細胞體系微環(huán)境傳感、多組分檢測以及細胞成像研究。但SERS探針獲得的信息可能受到細胞復(fù)雜環(huán)境的影響，因此靈敏、可靠地對細胞體系進行監(jiān)測是間接檢測的核心問題。此外，如何在開展研究的同時盡量保證細胞活性以及生命活動的正常進行也是細胞體系研究需要重視的問題。
　

5、　針對以上問題，本論文發(fā)展了基于SERS技術(shù)的可靠、靈敏的直接和間接檢測方法來開展細胞體系的相關(guān)研究，主要內(nèi)容和成果如下:
　　1.發(fā)展了適用于生物分子直接檢測的亞穩(wěn)態(tài)SERS檢測方法，通過對樣品制備和SERS檢測方式的改進確保了用于生物分子檢測時的靈敏度和可靠性。利用基于金納米粒子的亞穩(wěn)態(tài)SERS檢測方法首次獲得了構(gòu)成生物體各種蛋白質(zhì)的20種常見氨基酸分子的高靈敏、可重現(xiàn)的SERS光譜，并成功拓展至多肽以及蛋白的SERS直接檢測

6、。
　　2.采用小牛血清蛋白(BSA)作為保護分子對探針表面進行修飾的方法制備了基于SERS技術(shù)的pH傳感納米探針并用于活細胞內(nèi)的可靠pH傳感。pH傳感探針主要由三部分組成:金納米粒子作為SERS增強基底，對巰基吡啶(4-MPy)作為pH傳感分子吸附在金納米粒子表面，最外層的BSA作為保護分子層起到了避免探針嚴(yán)重聚集、保護信號分子的穩(wěn)定性以及改善探針生物相容性的重要作用。通過系統(tǒng)的表征，該pH傳感納米探針表現(xiàn)出了優(yōu)越的pH響應(yīng)效果

7、以及應(yīng)用于細胞體系時的穩(wěn)定性、可靠性和生物相容性。將這種靈敏、可靠的pH傳感納米探針與活細胞共孵育后進行SERS成像，獲得了單個活細胞內(nèi)pH分布圖像。在此基礎(chǔ)上，進一步對探針進行了穿膜肽修飾用以提高探針的細胞內(nèi)化效率，實現(xiàn)了細胞內(nèi)pH分布的高效成像以及SERS-熒光雙模式成像。
　　3.通過對大面積、均一、具有高增強SERS效應(yīng)的金納米粒子組裝基底進行pH傳感分子(4-MPy)的修飾，制備了基于SERS技術(shù)的pH傳感基底用于貼壁活

8、細胞外的可靠pH傳感。首先探究了4-MPy在金納米粒子組裝基底上的吸附行為和SERS光譜變化機制并系統(tǒng)地表征了pH傳感基底的pH響應(yīng)效果、靈敏度、穩(wěn)定性、循環(huán)性能、響應(yīng)速度和可靠性。隨后，對在pH傳感基底上的貼壁活細胞進行SERS成像，獲得了單個活細胞外pH分布圖像。
　　4.為了盡量保證活細胞研究中細胞的活性，建立了細胞原位培養(yǎng)與顯微檢測平臺。通過顯微觀察，活細胞在原位培養(yǎng)狀態(tài)下的生命活動狀態(tài)更為活躍，體現(xiàn)了原位培養(yǎng)對于開展活細