甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞TGF-β-smad信號(hào)通路的影響.pdf

1、本研究分為三部分：
　　第一部分：磷酸化smad2(P-smad2)、磷酸化smad3(P-smad3)在瘢痕疙瘩及正常皮膚組織中表達(dá)水平差異的研究
　　目的:使用免疫組化分析磷酸化smad2(P-smad2)、磷酸化smad3(P-smad3)蛋白在瘢痕疙瘩及正常皮膚組織中的表達(dá)差異。
　　方法:收集48例經(jīng)手術(shù)切取的瘢痕疙瘩組織及48例正常皮膚組織。免疫組化檢測P-smad2及P-smad3，在200倍和400倍鏡

2、下觀察這兩種蛋白的表達(dá)分布情況。
　　結(jié)果:在瘢痕疙瘩組織中，P-smad2及P-smad3蛋白的陽性率均高于正常皮膚組織(p＜0.05)。
　　結(jié)論:P-smad2及P-smad3蛋白在瘢痕疙瘩組織中高表達(dá)，與正常皮膚表達(dá)水平的差異提示它們可能參與了瘢痕疙瘩的形成，為后續(xù)相關(guān)藥物治療機(jī)理的研究提供了一定基礎(chǔ)。
　　第二部：分瘢痕疙瘩及正常皮膚組織成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)與5-氮雜-2-脫氧胞苷對(duì)該成纖維細(xì)胞的生長周期及凋

3、亡的影響
　　目的:原代提取并培養(yǎng)足夠數(shù)量的瘢痕疙瘩及正常皮膚組織成纖維細(xì)胞，使用甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷進(jìn)行干預(yù)，流式細(xì)胞學(xué)分析瘢痕疙瘩組織成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡的變化。
　　方法:組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)瘢痕疙瘩及正常皮膚組織，獲得的成纖維細(xì)胞使用5-氮雜-2-脫氧胞苷進(jìn)行干預(yù)，流式細(xì)胞學(xué)分析細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果:培養(yǎng)的瘢痕疙瘩及正常皮膚組織塊約7天可觀察到成纖維細(xì)胞從中“爬出”。14天后細(xì)

4、胞可長滿整個(gè)培養(yǎng)瓶（規(guī)格:50毫升）。5-氮雜-2脫氧胞苷干預(yù)后，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞處于G0/G1期的比例增加，細(xì)胞凋亡也較對(duì)照明顯增多。正常皮膚成纖維細(xì)胞于藥物干預(yù)前后未發(fā)現(xiàn)顯著變化。
　　結(jié)論:5-氮雜-2-脫氧胞苷干預(yù)后，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞處于G0/G1期的比例增加，細(xì)胞凋亡也較對(duì)照明顯增多，表明5-氮雜-2-脫氧胞苷能夠有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡。
　　第三部分：5-氮雜-2-脫氧胞苷對(duì)體外培養(yǎng)的

5、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞相關(guān)因子的影響
　　目的:研究5-氮雜-2-脫氧胞苷體外干預(yù)瘢痕疙瘩及正常皮膚組織成纖維細(xì)胞后，TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。
　　方法:凝膠電泳PCR檢測瘢痕疙瘩及正常皮膚組織成纖維細(xì)胞在5-氮雜-2-脫氧胞苷干預(yù)前后膠原蛋白Ⅰ(Coll-Ⅰ)的mRNA表達(dá)變化，Westernblot檢測各組P-smad2、P-smad3、TGF-β1、smad7、Coll-Ⅰ蛋白的表達(dá)變化。
　

6、　結(jié)果:5-氮雜-2-脫氧胞苷干預(yù)后，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的Coll-Ⅰ mRNA表達(dá)下降，P-smad2、P-smad3、TGF-β1、Coll-Ⅰ蛋白表達(dá)下降，smad7蛋白表達(dá)回升。而正常皮膚成纖維細(xì)胞在藥物干預(yù)前后無明顯差異。
　　結(jié)論:5-氮雜-2-脫氧胞苷作用瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞后，TGF-β/Smad信號(hào)通路中TGF-β1表達(dá)減少，抑制型smad因子smad7表達(dá)增多，抑制了smad2及smad3的磷酸化（P-smad2