小鼠GV期卵母細胞發(fā)育潛能評價和GDNF對牛卵母細胞體外成熟、受精和胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、第一部分實驗研究
　　第一章小鼠GV期卵母細胞發(fā)育潛能評價
　　卵母細胞作為雌性生殖細胞，為哺乳動物繁殖提供遺傳物質(zhì)基礎，并支持著床前胚胎的發(fā)育。卵母細胞成熟質(zhì)量直接決定了早期胚胎能否正常發(fā)育。卵母細胞質(zhì)量評價標準的建立對體外胚胎發(fā)育的預測具有重要作用。在臨床上，對于有排卵障礙的病例而言，生發(fā)泡(Germinal Vesicle，GV)期卵母細胞的體外成熟、體外受精或單精注射是人類輔助生殖技術的重要組成部分，因此，篩選優(yōu)良發(fā)

2、育潛能的GV期卵母細胞是人類輔助生殖技術成功的前提。
　　卵丘細胞層厚度(thickness of cumulus layers，C)、透明帶厚度(thickness ofzona pellucida，Z)和帶下間隙寬度(perivitelline space，P)是卵母細胞形態(tài)學評價的三個重要參照物。然而，這三個形態(tài)學特征與GV期卵母細胞質(zhì)量之間的關系還并未被廣泛研究。本實驗以小鼠為研究對象，對卵丘細胞層厚度、透明帶厚度和帶下間

3、隙寬度進行分級，研究了這三個形態(tài)學特征與GV期卵母細胞質(zhì)量的關系。更進一步，通過人為改變卵丘細胞層厚度、透明帶厚度和帶下間隙寬度，深入研究了這三個形態(tài)學指標作為評價卵母細胞發(fā)育潛能標準的可靠性。
　　我們的研究結果表明:(1)帶有三層及以上卵丘（C≥50μm）的卵母細胞具有較高的成熟率、受精率和胚胎發(fā)育率，人為去除部分卵丘雖不影響卵母細胞的體外成熟率，但影響了后期的受精率和胚胎發(fā)育率。(2)透明帶厚度在5-8μm之間（5μm≤Z＜

4、8μm）的卵母細胞具有較高的成熟率，透明帶厚度小于5μm（Z＜5μm）的卵母細胞不能夠正常成熟和受精。人為將透明帶厚度從大于或等于8μm（Z≥8μm）變薄至5-8μm(5μm≤ Z＜8μm)，雖然可以提高卵母細胞成熟率，但不能提高受精率和發(fā)育率。(3)較寬的帶下間隙(P≥5μm)有利于卵母細胞極體的排放，但不利于卵母細胞的受精和胚胎發(fā)育。帶下間隙小于1μm(P＜1μm)的卵母細胞不能夠成熟，即使人為擴大帶下間隙，也不能夠改善卵母細胞的發(fā)

5、育潛能。
　　我們的實驗結果證明了GV期卵母細胞的卵丘細胞層厚度、透明帶厚度和帶下間隙厚度可以作為預測卵母細胞成熟、受精和胚胎發(fā)育潛力的指標，這些結果為人類輔助生殖提供參考數(shù)據(jù)，對提高人類輔助生殖成功率有重要意義。
　　第二章GDNF對牛卵母細胞成熟、受精和早期胚胎發(fā)育的影響
　　對于大多數(shù)哺乳動物而言，繁衍后代是生命周期中除個體生存之外最重要的生命活動。后代的繁衍起始于雌性動物卵母細胞生長、成熟、受精和早期胚胎發(fā)育。

6、對于良種家畜例如牛和羊而言，人們常采用體外受精(In Vitro Fertilization，IVF)和胚胎移植(Embryo transfer,ET)技術進行擴繁，并且IVF-ET技術是動物轉基因技術研究關鍵步驟之一。這一技術是以卵母細胞的體外成熟開始的，因此，卵母細胞成熟質(zhì)量的好壞直接影響了后代的產(chǎn)出。
　　卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程中除內(nèi)源性的基因表達與調(diào)控之外，外界信號分子也是影響其能否正常發(fā)育的重要調(diào)控方式之一。這種

7、調(diào)控最常見也是最直接的方式之一就是通過旁分泌因子來發(fā)揮作用。GDNF是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，最早是從大鼠膠質(zhì)瘤細胞系上清液中分離出來的。研究發(fā)現(xiàn)它對小鼠、豬卵母細胞成熟、受精和早期階段胚胎的發(fā)育起重要作用。因此，我們利用牛卵母細胞作為實驗材料，研究了GDNF對成熟、受精和胚胎發(fā)育的作用。
　　我們采用了免疫組化和免疫熒光方法，研究了GDNF在成熟卵泡、GV期卵母細胞、MⅡ期卵母細胞和早期胚胎中的定位。卵母細胞成熟液和早期胚胎發(fā)育液中添

8、加適量的GDNF因子對牛卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育的影響。用特異性的siRNA干擾受體GFRA1的表達量，統(tǒng)計牛卵母細胞成熟率。
　　我們的結果表明，(1)牛GV期卵母細胞中未發(fā)現(xiàn)GDNF因子，只檢測到它的受體;而卵母細胞成熟的其他時期和胚胎發(fā)育的各個時期中均檢測到GDNF及它的受體信號。(2)添加適量的GDNF對卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育具有促進作用。(3)干擾GFRA1的表達，導致牛卵母細胞成熟率顯著低于對照組。我們的實驗結果